本发明专利技术涉及一种溶栓酶，具体地说是一种由蜡状芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）所产生的溶纤维蛋白酶，即蜡激酶。本发明专利技术提供的蜡激酶在ＨＰＬＣ检测条件：色谱柱：Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐａｋ↑［ＴＭ］６０ ７．８×３００ｍｍ；流动相：０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ↓［２］ＰＯ↓［４］－ＣＨ↓［３］ＯＨ（９５∶５）；流速：１ｍｌ／ｍｉｎ；检测波长：２２０ｎｍ，有ＨＰＬＣ指纹图谱，峰在７～９ｍｉｎ之间。本发明专利技术还提供了蜡激酶的制备方法。本发明专利技术还提供了蜡样芽孢杆菌以及本发明专利技术蜡激酶在制备治疗血栓疾病药物中的用途。大鼠颈动脉血栓形成试验表明，本发明专利技术提供的蜡激酶具有较明显的抗血栓形成作用，为治疗血栓疾病提供了一种新的用药选择。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蜡样芽孢杆菌在制备治疗血栓疾病药物中的用途，具体地说是一种由蜡样芽孢杆菌所产生的溶纤维蛋白酶在制备治疗血栓疾病药物中的用途，属于生物医药领域。
技术介绍
血栓疾病是危害人类健康的主要疾病之一，如脑血栓、急性心肌梗死的死亡率已达40％以上，血栓病逐渐成为死亡率占首位的病症。溶解血栓是治疗这类疾病的重要手段。当今用于临床治疗的溶栓药物如链激酶(Streptokinase，SK)、尿激酶(Urokinase，UK)、重组组织型纤溶酶原激活剂(Recombinant Tissue-type Plasminogen Activator，rt-PA)等均存在一定的缺陷毒性较强、副作用较大、体内半衰期短、价格昂贵等。纳豆激酶(Nattokinase，NK)，是从纳豆中提取的一种丝氨酸蛋白酶。这种溶纤维蛋白酶(Plasmin)由275个氨基酸组成，无毒、无副作用。相对分子量为27728，远远小于尿激酶等，因此作为药物具有易于吸收的优点。等电聚焦显示其pI为8.6±0.3，在pH6.0～12.0的条件下稳定，低于pH5.0则不稳定。通过人体实验发现纳豆激酶能将纤维蛋白溶酶原、尿激酶原激活成纤维蛋白溶酶和尿激酶而达到溶血栓的效果，同时还发现纳豆激酶可激活血浆中组织型溶纤酶原激活剂(Tissue-type Plasminogen Activator，t-PA)的产生，从而间接表现出其溶栓活性。纳豆激酶在自然状态下较稳定，且在胃肠环境中不会失活。实验发现它不仅作用迅速，而且疗效时间长。纳豆激酶制剂的口服及其纤溶作用实验显示至第4小时活性达最高，然后开始下降，至8小时仍有作用。同时发现内源组织型纤溶酶原激活剂的量亦有增加，表明纳豆激酶通过肠道吸收进入血液后除它本身的纤溶活性外，还激活血管内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)，增加其内源纤溶活性。而且纳豆激酶是直接破坏交链纤维蛋白，而不是破坏体内的纤维蛋白原。纳豆激酶的纤维蛋白原水解活性远低于纤溶酶和尿激酶，与t-PA基本相同。提示纳豆激酶在发挥纤溶作用时，不易引起出血倾向。蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)又称蜡样芽孢杆菌，广泛分布于自然界中。菌体杆状，直或接近直，0.3～2.2×1.2～7.0微米。多数运动；鞭毛典型侧生。形成抗热内生孢子；在一个孢子囊中，孢子不多于1个。暴露于空气中时，不妨碍孢子的形成。革兰氏反应为阳性、仅在生长早期为阳性、阴性。孢子椭圆或柱状，孢子囊不明显膨胀，孢子中生；接触酶、V.P反应、厌氧生长阳性，50℃生长阴性，平板菌落和斜面划线生长呈蜡质状。有些菌株报道的DNA的G+C含量为32～33克分子％(熔解温度法)和33～37克分子％(分析法)。杆状菌体有成链的趋势；链的稳定性决定了菌落的形态，在不同的菌株中菌落形态变化很大。一种特殊的菌落为暗的或毛玻璃状，并有起伏的边缘，从边缘移出的生长物不发育。另一种特殊菌落，根状生长，在洋菜表面上广泛扩展。生长物呈现不规则地纠缠，在不同的菌株中，它们的根状多以顺时针弯曲或呈逆时针弯曲。目前为止，未见蜡样芽孢杆菌用于制备治疗血栓疾病的药物中相关报道，也未见由蜡样芽孢杆菌所产生的溶纤维蛋白酶用于制备治疗血栓疾病的药物中相关报道。
技术实现思路
本专利技术的技术方案是提供蜡样芽孢杆菌在制备治疗血栓疾病药物中的用途，本专利技术的另一技术方案是提供一种用于治疗血栓疾病的溶栓酶，具体地说是一种由蜡样芽孢杆菌所产生的溶纤维蛋白酶，在本专利技术中，专利技术人将其命名为蜡激酶，英文名Cerekinase，CK。本专利技术供了蜡样芽孢杆菌用于制备治疗血栓疾病药物中的用途以及一种由蜡样芽孢杆菌所产生的溶纤维蛋白酶，即蜡激酶用于制备治疗血栓疾病药物中的用途。本专利技术提供的由蜡样芽孢杆菌所产生的溶纤维蛋白酶，即蜡激酶(Cerekinase，CK)，有如下HPLC指纹图谱特征HPLC检测条件色谱柱Waters Proein-PakTM60 7.8×300mm流动相0.2mol/L NaH2PO4-CH3OH(95∶5)流速1ml/min检测波长220nm蜡激酶在7～9min之间出峰。所述蜡激酶是由以下方法制备得到a、中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NOM204092的蜡样芽孢杆菌DIAO 1502(Bacillus cereus Diao 1502)，培养后作为发酵用种子液；b、利用a步骤种子液经液态发酵或固态发酵得到本专利技术蜡激酶。其中，所述液态发酵为种子液按照5％～20％ v/v(以培养基的体积为基准)的接种量接入发酵培养基中，于30～40℃，180～220rpm培养24～72h，离心，上清液滤膜浓缩，喷雾干燥后得到本专利技术蜡激酶成品。液态发酵培养基(g/L)为C源5～35，N源5～45，Na2HPO4·12H2O 0.5～3，NaH2PO4·2H2O 0.5～4，CaCl20.05～1，MgSO4·7H2O 0.05～1.5，pH7.5±1.0，121℃灭菌20min。其中，C源(蔗糖)可以用葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、糖蜜等代替，N源(大豆蛋白胨)可以用玉米浆、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨(植物、动物)、豆浆等代替。所述喷雾干燥，添加20％～40％(W/V)的硬脂酸美、β-环状糊精、明胶、大豆分离蛋白、糊精中的一种或几种辅料。所述固态发酵为将豆渣喷洒营养液(重量配比为每1000g豆渣喷洒营养液20～120ml)，于100℃蒸煮得到培养基，冷却后将制备好的种子液按照5％～20％ v/w(以培养基的重量为基准)的接种量接入培养基中。培养基于30～45℃，湿度≥80％，培养12～56h，干燥后得到本专利技术蜡激酶成品。其中，固态发酵营养液组分(g/L)甘油50～300，蛋白胨50～300，牛肉膏50～100，Na2HPO4·12H2O 5～20，NaH2PO4·2H2O 5～20，CaCl20.5～10，MgSO4·7H2O 0.5～10，pH7.5±1.0。本专利技术还提供了蜡激酶的制备方法a、种子液制备本专利技术使用的菌种是由具有溶栓能力的发酵性食品中分离得到，由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，并且予以保藏，保藏编号为M204092。工作种子批菌种启开后，营养琼脂(NA)培养基平板培养，保存于NA试管斜面，经过形态、纯度、生产能力检查合格后，(即在培养好的NA试管斜面上勾取少量培养物涂片，革兰氏染色后显微镜下观察，凡镜下形态一致，无杂菌污染的种子为合格种子。生产能力检查是通过实验室水平的发酵来检测菌株的生产能力(即每毫升发酵液的酶活)，凡生产能力大于1000IU/ml即为合格种子。)作为生产用种子，种子于30～40℃，180～220rpm，NB培养基中培养8～24h作为一级种子；然后按5～10％的接种量接种于NB(营养肉汤)培养基中，于30～40℃，180～220rpm培养8～24h可作为二级种子，也可作为发酵用种子液。b、发酵所述发酵可以是液态发酵或固态发酵。本专利技术所述培养基为营养肉汤(NB)培养基，供摇床培养用；营养琼脂(NA)培养基供制备平板和斜面用，含0.5％琼脂的营养肉汤(NB)培养基供短期保存菌种用。NB培养基(g/L)蛋白胨10、牛肉浸膏5、氯化钠5本文档来自技高网...
【技术保护点】
中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｍ２０４０９２的蜡样芽孢杆菌ＤＩＡＯ１５０２（ＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓＤｉａｏ１５０２）在制备治疗血栓疾病药物中的用途。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈军，魏琪，蒋飞，赖亚娜，何俊蓉，
申请(专利权)人：成都地奥九泓制药厂，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]
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