一种基于代谢组学技术的有机污染物细胞毒性作用机制的研究方法技术

本发明专利技术公开了一种基于代谢组学技术的持久性有机污染物细胞毒性作用机制的研究方法，首先通过有机污染物对HepG2细胞的暴露，利用UHPLC/Q‑Trap MS能有效地对胞内及胞外培养液代谢产物进行分析，结合统计学处理及代谢路径分析能直观地反映有机污染物对细胞代谢路径地影响，并利用生物学检测方法能进一步对相关代谢通路限速酶活性进行快速分析。根据细胞内代谢物含量的变化及其所在代谢路径中限速酶活性的变化阐明了有机污染物的细胞毒性作用机制，基于分子生物学构建了一种污染物毒性作用机制评估方法。本发明专利技术具有易于操作，检测快速，灵敏度高，选择性强，重复性好，获得信息量全面等优点。

A study on the mechanism of cytotoxic action of organic pollutants based on metabonomics

The invention discloses a method to study the mechanism of persistent organic pollutants in the cytotoxicity of metabonomics based on the first through the organic pollutants on HepG2 cells exposed by UHPLC/Q Trap MS effectively on intracellular and extracellular medium metabolites were analyzed, combined with statistical analysis and metabolic pathway analysis can directly reflect the influence of organic pollutants on cell metabolic pathways, and the use of biological detection methods can be further related to the metabolic pathway of the enzyme activity for rapid analysis. Based on the change of intracellular metabolites and the activity of speed limiting enzymes in metabolic pathway, the cytotoxic mechanism of organic pollutants was elucidated. Based on molecular biology, a method of evaluating the toxicity mechanism of pollutants was constructed. The invention has the advantages of easy operation, rapid detection, high sensitivity, strong selectivity, good repeatability, and comprehensive information.

【技术实现步骤摘要】
一种基于代谢组学技术的有机污染物细胞毒性作用机制的研究方法
本专利技术属于污染物毒性评价领域，涉及一种基于分子生物学的评估方法，通过污染物对细胞代谢路径的影响来评估小剂量环境污染物的细胞毒性作用机制。
技术介绍
持久性有机污染物(persistentorganicpollutants，POPs)具有环境持久性、生物蓄积性、半挥发性的特点，且极难降解、毒性强，能够通过大气、河流、海洋等环境介质进行全球性迁移。因此，POPs污染成为倍受关注的全球性环境热点问题。目前为止，被斯德哥尔摩列入POPs中化合物有艾氏剂、氯丹、滴滴涕、狄氏剂、异狄氏剂、七氯、灭蚁灵、毒杀芬、六氯苯、二噁英、呋喃、多氯联苯、α-六氯环己烷、β-六氯环己烷、γ-六氯环己烷、五氯苯、十氯酮、六溴联苯、四溴联苯醚和五溴联苯醚、六溴联苯醚和七溴联苯醚、全氟辛烷磺酸及其盐类和全氟辛基磺酰氟、硫丹、六溴环十二烷，提议列入POPs的新增候补清单的有短链氯化石蜡、多氯萘、五氯苯酚等等。为了能对POPs进行严格控制和削减，需要对POPs进行全面的生态及人类健康风险评估。POPs的人类健康风险评估一般借助于传统毒理学手段进行评估，但是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种持久性有机污染物细胞毒性作用机制的评估方法，其特征在于：包括以下步骤：(a)有机污染物对细胞进行暴露培养24小时后，收取细胞及胞外培养液样品，作为暴露组；以没有采用有机污染物对细胞进行暴露的、且与暴露组同样条件培养24小时后，收取的细胞及胞外培养液样品，作为控制组；(b)采用液液萃取法分别对暴露组和控制组的胞内及胞外代谢物进行提取，得到代谢产物提取液；(c)利用基于UHPLC/Q‑Trap MS的质谱方法对步骤a所得代谢产物提取液中代谢产物进行定量分析；(d)统计学分析处理UHPLC/Q‑Trap MS检测的胞内代谢产物，将暴露组和控制组所得的代谢产物定量分析结果进行比对，找出暴露组相对于...

【技术特征摘要】
1.一种持久性有机污染物细胞毒性作用机制的评估方法，其特征在于：包括以下步骤：(a)有机污染物对细胞进行暴露培养24小时后，收取细胞及胞外培养液样品，作为暴露组；以没有采用有机污染物对细胞进行暴露的、且与暴露组同样条件培养24小时后，收取的细胞及胞外培养液样品，作为控制组；(b)采用液液萃取法分别对暴露组和控制组的胞内及胞外代谢物进行提取，得到代谢产物提取液；(c)利用基于UHPLC/Q-TrapMS的质谱方法对步骤a所得代谢产物提取液中代谢产物进行定量分析；(d)统计学分析处理UHPLC/Q-TrapMS检测的胞内代谢产物，将暴露组和控制组所得的代谢产物定量分析结果进行比对，找出暴露组相对于控制组含量显著变化的代谢产物，并进一步做出这些代谢产物的相关网络图；(e)代谢路径分析对胞内代谢产物进行深入分析，pathway分析找到受有机污染物显著影响的代谢通路，并对受显著影响的代谢路径中限速酶活性进行测定，可以判断出有机污染物对细胞的毒性作用方式。2.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤a中，细胞在六孔板中培养，接种细胞密度为3×105个/孔,六孔板内每孔培养液体积为2.5mL；在培养箱内培养的条件为37℃，空气中含5％(v/v)的CO2；当细胞铺满孔板被培养液覆盖面积的80％左右时，移弃原培养液，每孔加入含DMSO为0.05％(v/v)、含污染物合适暴露浓度的培养液2.5mL，另外设置控制组，即加入仅0.05％(v/v)DMSO的培养液；每个暴露组及控制组各自都用一个六孔板的所有孔，即设置六个平行；在培养箱内培养的条件为37℃，空气中含5％(v/v)的CO2。3.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于：步骤b中，提取细胞内及胞外培养液中小分子代谢产物的过程为液液萃取法，萃取分为两步：第一步，首先收集六孔板中每孔胞外培养液到单独离心管中，然后用液氮淬灭贴壁细胞，胞外培养液和六孔板均存放在-80℃；接着每孔细胞加入1mL去离子水，在冰水浴中超声破碎，超声破碎时间为5min，得到破碎悬液，移出每孔内的破碎悬液分别置于单独的离心管中；取200μL细胞外培养液到新的离心管中，与装有细胞破碎悬液的离心管一起进行冷冻干燥；第二步，冻干后每个离心管加入500μL提取液(80％(v/v)甲醇/水，包含六个内标，L-苯丙氨酸-D5(0.5mg/L)，氘代辛酰(8,8,8-D3)-L-盐酸肉碱(0.5mg/L)，溶血磷脂酰胆碱(12:0)(0.5mg/L)，磷脂酰乙醇胺(17:0)(1mg/L)，十一烷酸(0.5mg/L)，十九烷酸(0.5mg/L))，涡旋20min混匀，高速离心，即8℃下离心20min，转速为13000rpm，注射器取上清并且过有机相滤器后直接用于UHPLC/...

【专利技术属性】
技术研发人员：王菲迪，陈吉平，张海军，耿柠波，张保琴，任晓倩，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21