本发明专利技术涉及文昌鱼ＡｍｐｈｉＧＡＬ１３基因及其编码的蛋白，以及该蛋白在制备一种新的生物黏附剂的应用。本发明专利技术通过ｃＤＮＡ文库构建和大规模测序的方法，从文昌鱼消化道中分离得到文昌鱼ＡｍｐｈｉＧＡＬ１３基因，其ＤＮＡ序列如序列表中〈４００〉１序列所示。该基因编码的蛋白（Ｐ↓［ＧＡＬ１３］），其氨基酸序列如序列表中〈４００〉２序列所示。本发明专利技术通过ＧＳＴ融合表达重组文昌鱼ＧＳＴ－Ｐ↓［ＧＡＬ１３］蛋白，经ＥＫ酶消化后得到的具有凝集素的一般功能，能够作为一种天然的小分子的生物黏附微粒制剂的开发和应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及文昌鱼半乳糖凝集素(AmphiGAL13)基因及其编码的蛋白PGAL13，以及该蛋白作为一种潜在的生物黏附微粒制剂的应用。
技术介绍
文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)，属于脊索动物门(Chordata)，头索动物亚门(cephalochordate)，是现存和脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物，也是脊椎动物祖先的模型，是海洋中较原始的动物类。凝集素是一种结合特异糖类的蛋白质或糖蛋白。凝集素介导的生物黏附现象是由“凝集素-糖基”相互作用产生的。这种相互作用可以分为两类(1)外源性凝集素与内源性糖基结合。上皮细胞表面具有多糖蛋白复合物的细胞，因此在其表面可以暴露许多糖残基。凝集素是一种蛋白质或非免疫源性糖蛋白，可以特异性识别糖分子，与糖基化膜成分结合，再通过结合的特异性黏附配体把生物信号传达给细胞进行胞吞或胞饮。这种相互作用不仅导致黏附，而且使其通过不同的途径内化(溶酶体或非溶酶体)。(2)内源性凝集素与外源性糖基结合。机体本身所含凝集素能与外来的糖基特异性结合，原理与第一类相似。目前药剂学上应用较多的为第一类。不同的凝集素具有不同的配体，相应具有不同的作用位点。凝集素的作用部位主要在M细胞和肠细胞。这些细胞抗原结构的特异性和强的胞饮能力使其在吸收大分子和微粒方面很有效。而且作用点是药物特定的吸收窗或局部病变区域，如某些癌细胞分泌的非正常糖蛋白具有特异的糖基，有利于凝集素发挥作用。凝集素作为一种生物黏附剂开发有较大的前景。关于凝集素介导的黏附微粒给药体系在鼻腔、口腔和眼部的应用都已有报道动物。实验结果表明，利用凝集素产生的黏附性可以提高鼻腔给药的有效性。Nicholls等证实凝集素能与在体小鼠眼球表面上皮细胞快速、稳定地结合(结合的时间在10秒之内)。Schaeffer等进一步证实凝集素介导的药物给药体系能有效的穿过角膜上皮层。这些结果都清楚地表明，适当结合凝集素可延长药物在眼球表面的停留时间而提高药物吸收。在凝集素众多的给药系统中，对胃肠道给药系统的研究最为深入。凝集素经胃肠道给药后，体内会产生一种受体介导的内吞作用，总体上有三大优点(1)凝集素的特异结合活性能延长微粒在肠内的滞留时间，包裹的药物能从骨架内缓慢释放，生物利用度提高；(2)凝集素的特异结合活性能将微粒靶向至肠道上皮细胞的特定位点，然后药物通过凝集素介导的内吞被细胞内化，对靶点上皮细胞产生效应，这是将水溶性药物靶向肠道癌细胞的理想方式；(3)受体介导的内吞导致了药物的胞饮作用和胞吞转运作用，可用于提高水溶性多肽、蛋白类药物的吸收。生物黏附给药系统是近年发展较快的新给药系统，凝集素介导的生物黏附微粒给药系统又是进入20世纪90年代以后该给药系统的一种新拓展。这一给药系统在改善吸收差、体内不稳定药物特别是肽类、蛋白质和疫苗的生物利用度方面具有重要意义。其不仅可以防止蛋白类药物被蛋白分解酶降解，而且可以增加大分子药物透过上皮细胞层进入血循环的量。凝集素微粒给药系统要成为一个成熟的给药系统尚有许多问题有待解决。目前就凝集素本身而言，一个较有前景的研究方向是设计合成一些分子结构更小、毒性和免疫源性更低、但又保持凝集素活性部位的凝集素类似物。文昌鱼是一种介于脊椎动物和无脊椎动物之间的过渡的一种生物，它既保留了无脊椎动物的一些特性，又具有脊椎动物的某些特点。在文昌鱼中发现的半乳糖凝集素分子已经具有了脊椎动物凝集素分子的基本结构和凝集活性，而相对于脊椎动物而言分子结构比较原始，毒性和免疫源性更低，作为一种的天然的生物黏附微粒制剂进行开发利用具有很大的开发前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的文昌鱼AmphiGAL13基因及其编码的蛋白。本专利技术的另一目的在于提供上述基因的PGAL13蛋白作为一种新型的生物黏附微粒制剂的利用。本专利技术通过cDNA文库的构建和大规模测序的方法，从文昌鱼消化道中分离得到消化道AmphiGAL3基因，其DNA序列如序列表<400>1序列所示。上述本专利技术基因AmphiGAL13所编码的蛋白(命名为PGAL13)，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；等电点为8.68，分子量为16,985道尔顿。该蛋白通过表达载体pGEX-AmphiGAL13在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达。所述表达载体pGEX-AmphiGAL13是建立以谷胱甘肽转移酶为融合伴体，中间插入凝血酶和肠激酶识别位点的高效表达载体，该系统使PGAL13在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达。本专利技术所选择的青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)采集于山东省沙子口水域。青岛文昌鱼消化道cDNA文库的构建提取消化道总RNA，通过反向PCR合成一链DNA，然后通过LD-PCR合成双链DNA，经Sfi I酶切后，与pcDNA3.0连接转化E.coli，构建cDNA文库。本专利技术通过对文库重组克隆大规模序列测定，从中得到了1个新的编码文昌鱼Galectin的克隆，命名为AmphiGAL13(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码154个氨基酸(其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示)，等电点为8.68，分子量为16,985道尔顿，具有保守的Galectin与结合的活性位点。本专利技术还提供了融合蛋白的表达方法，包括步骤(1)重组表达载体pGEX-AmphiGAL13的构建；(2)将pGEX-AmphiGAL13转化大肠杆菌BL21(DE3)；(3)对转化的大肠杆菌BL21(DE3)进行培养。具体为通过设计了一对引物，将编码新基因AmphiGAL13克隆到原核融合表达载体pGEX-4T上，构建表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。此表达载体pGEX-AmphiGAL13以GST为分子融合伴体，帮助重组蛋白正确折叠，以可溶的形式表达，表达的GST融合蛋白可以通过glutathione-Sepharose亲和层析进行纯化。载体上含有凝血酶的酶切位点，由于本实验室构建有高效的肠激酶(EK)的生产系统，在所设计的上游引物含有EK酶的位点，都可以利于外源蛋白单体的获得。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，PGAL13融合蛋白的表达量较高，大部分处于可溶状态。本专利技术还摸索和优化了重组PGAL13蛋白的纯化条件，表达产物的超声裂解液经glutathione-Sepharose亲和色谱层析，得到融合蛋白，融合蛋白经EK酶切割和lacytosyl-sepharose亲和色谱层析，可得到纯度在90％以上的PGAL13蛋白。本专利技术的表达质粒复制方法参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl2的方法将质粒转化E.coli.DH5α或BL21(DE3)菌株，用含氨苄青霉素(100mg/L)的2×TY培养基培养转化菌株，碱法提取质粒。附图说明图1为本专利技术的文昌鱼PGAL13蛋白和其它物种Gal本文档来自技高网...
【技术保护点】
从文昌鱼消化道中分离得到一个原型的半乳糖凝集素分子ＡｍｐｈｉＧＡＬ１３，其ＤＮＡ序列如序列表〈４００〉１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐安龙，禹艳红，余英才，元少春，董美玲，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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