本发明专利技术涉及从水稻东格鲁杆状病毒（ＲＴＢＶ）分离和表征新的核苷酸序列，所述的核苷酸序列在植物中显示出启动子活性。本发明专利技术进一步涉及通过将全长以及缺失型的ＲＴＢＶ启动子序列与细菌报告基因ＧＵＳ融合来分析ＲＴＢＶ启动子的功能结构域。本发明专利技术也涉及在不同的发育阶段的转基因水稻和烟草植物的多种组织中研究报告基因的表达。本发明专利技术还描述了ＲＴＢＶ启动子及其缺失型，其以组成性或组织特异性的方式作用来驱动异源核酸序列在单子叶和双子叶植物、细胞和组织中表达。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及从水稻东格鲁杆状病毒(rice tungro bacilliformvirus，RTBV)分离新的核苷酸序列，所述的核苷酸序列在转基因植物中显示出启动子活性。其进一步涉及RTBV启动子中的功能结构域的表征，其中所述的启动子序列以组成性或组织特异性方式作用来驱动异源核酸序列在单子叶和双子叶植物、细胞和组织中表达。
技术介绍
水稻认为是世界上最重要的粮食作物，因为它是多数人的食物热量的主要来源。为了将来给不断增长的食用稻米的人口继续提供足够的热量并提高基于稻米的食物的质量，必需改良水稻以便通过开发杂种优势来增加产量，抵抗不利条件例如虫害、病害、干旱、水涝、盐害和高温，以及整合更多的营养。对于多数这些改良，必须在水稻中引入和表达来自其它生物体的基因(通常称为转基因)。从农艺学观点来看，为了产生优良的水稻变种，必须将多种赋予理想特性的基因引入相同的转基因背景中。然而，完成基因累进增加(gene pyramiding)并不容易。为了确保转基因的稳定表达，必需将它们融合至称为启动子的特定的DNA元件，所述的元件作为从基因产生mRNA的控制单元发挥作用，这是基因表达的最重要阶段。这些序列在本质上，从它们起始转录加工并可调节转录的速率的方面来讲是调节性的。相对少量的启动子已经普遍用于在植物中表达转基因。此外，能在单子叶和双子叶植物两者中驱动高水平的组成型表达的启动子的数量甚至更少。而且，仅有少数可驱动组织或器官特异性表达的启动子。因此当前的科学难题在于鉴定新的调控元件以在获得理想的时间-空间上的mRNA表达模式方面引入更大多样性。研究已经表明在相同植物中使用相同的启动子来驱动两种截然不同的异源基因的表达可能会导致基因沉默。然而，该问题可通过对每种异源基因使用不同的启动子来解决。因而，需要鉴定能在多种植物中显示组织和/或发育特异性表达，并且能用于转基因表达的新启动子。本申请案提供了有关新启动子的信息，所述的新启动子是从水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)中鉴定并表征，从在印度WestBengal的田地里种植的受病毒感染的水稻中分离并修饰。花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV 35S)及其衍生物是用于该目的的最普遍使用的启动子。CaMV 35S在双子叶植物中有活性，但在单子叶植物中其相对强度基本上比在双子叶植物中低。其它双子叶植物启动子也已经用于单子叶植物转化，但对于单子叶植物活性趋向于降低(Wilmink等，1995)。已经鉴定数种启动子用于在单子叶植物中驱动高水平的转基因表达，例如水稻Act1启动子(McElroy等，1991)、水稻rbcS启动子(Kyozuka等，1993)、玉米Ubi1启动子(Toki等，1992；Cornejo等，1993)和水稻细胞色素C基因启动子OsCc1(Jang等，2002)。当然在这些启动子中，只有CaMV 35S(Terada和Shimamoto，1990)、水稻Act1、玉米Ubi1和水稻OsCc1在本质上是组成型的。在水稻中只确定了少数组织特异性启动子。例如，水稻种子储存蛋白谷蛋白(Gt1)启动子已经用于在水稻种子中表达转基因(Ye等，2000)以及水稻Glu-B1启动子已经用于大豆铁蛋白基因的胚乳特异性表达(Goto等，1999)。在水稻中表征的一些其它启动子包括已经显示为创伤诱导性的马铃薯pin2启动子(Xu等，1993)、在厌氧条件下在根部激烈诱导的玉米Adh1启动子(Kyozuka等，1991)以及叶肉特异性的玉米pep和rbcS启动子(Matsuoka等，1994)。Beachy、Roger N和Bhattacharyya、Maitrayee已经鉴定并表征了来自RTBV的启动子，其分离自菲律宾(美国专利5,824,857)。该启动子的用途涉及在转基因植物中驱动维管特异性表达。然而，本研究涉及鉴定并表征来自RTBV的启动子片段(分离自West Bengal，India)，所述的启动子片段与先前表征的RTBV启动子无明显同源性。该全长克隆的DNA序列已经存储于EMBL序列数据库中并且已经赋予了下列登记号AJ314596，但早先未说明该DNA序列的功能。本专利技术涉及鉴定来自RTBV的新的启动子(分离自West Bengal)以及它们在植物的转基因表达中的用途。专利技术目标本专利技术的主要目标是提供从水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)分离的启动子，所述的启动子具有如在序列列表中SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本专利技术的另一目标是提供缺失型的RTBV启动子，所述的启动子具有如序列表中所示的SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ IDNO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14和SEQ ID NO15。本专利技术的另一个目标是提供嵌合的植物转化载体，所述的载体包含可操作地连接至目标异源核苷酸序列的RTBV启动子(全长，FL)或其缺失型UD1、UD2、UD3、UD4、UD5和UD6(上游缺失型，UD)以及DD1、DD2、DD3、DD4、DD5、DD6、DD7和DD8(下游缺失型，DD)。此外本专利技术的另一个目的是提供嵌合的植物转化载体，其中所述的异源核苷酸序列编码能赋予植物改良的农艺学性状或者抗病害或虫害的抗性的多肽，所述的异源基因可操作地连接至上述RTBV启动子及其前述的衍生物上。此外本专利技术的另一目标是提供植物细胞、组织、器官和植物(单子叶植物或双子叶植物)，所述的植物细胞、组织、器官和植物用融合至异源核酸序列的多种RTBV启动子序列(SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14和SEQID NO15)转化。依然，本专利技术的另一个目标是提供在RTBV(FL)或上游缺失型(UD1、UD2、UD3、UD4、UD5、UD6)或者下游缺失型(DD1、DD2、DD3、DD4、DD5、DD6、DD7和DD8)启动子序列的调控下表达一种或多种目标异源核苷酸序列的方法。依然，本专利技术的另一个目标是提供产生转基因单子叶植物或双子叶植物的方法，所述的植物在RTBV(FL)或上游缺失型(UD1、UD2、UD3、UD4、UD5、UD6)或者下游缺失型(DD1、DD2、DD3、DD4、DD5、DD6、DD7和DD8)启动子序列的控制下表达异源核酸序列。
技术实现思路
本专利技术涉及从水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)分离新的核苷酸序列，所述的核苷酸序列在植物中显示出启动子活性。在此提供的核酸序列(从RTBV中分离)引导可操作地连接的核苷酸序列在单子叶植物和双子叶植物的细胞、组织和器官中的表达。本专利技术提供了含有如SEQ ID NO1(序列表)所示的核苷酸序列的RTBV启动子(FL，876bp)。而且，本专利技术提供了缺失型的RTBV启动子，即UD1(818本文档来自技高网...
【技术保护点】
来自水稻东格鲁杆状病毒的分离的启动子（ＲＴＢＶ启动子），所述的启动子由如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的核苷酸序列的片段组成。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：I达斯古普塔，S玛瑟，
申请(专利权)人：德里大学，
类型：发明
国别省市：IN[印度]
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