伪麻黄碱的生物制备方法技术

本发明专利技术公开了一种伪麻黄碱的生物制备方法，包括以下步骤：苯甲醛和乙烯、丙酮酸或丙酮酸盐在生物酶的催化作用下在缓冲溶液中反应，纯化，得到光学纯的式(S)‑1‑苯基‑2‑羰基‑3‑丙醇；光学纯的(S)‑1‑苯基‑2‑羰基‑3‑丙醇与甲胺在生物酶的催化作用下在缓冲溶液中反应生成(1S，2S)‑2‑甲氨基‑苯丙烷‑1‑醇，即为伪麻黄碱。本发明专利技术本发明专利技术原料供应充足，价格低廉，不需另行制备，试剂价格低廉，产物易重结晶纯化，成本低；酶催化直接生物转化生产伪麻黄碱，反应条件温和，适合工业化生产；反应条件易控制，操作简便，工艺流程简单，对设备无特殊要求，适于大规模生产。

Biological preparation method of pseudoephedrine

The invention discloses a biological preparation method comprises the following steps: pseudoephedrine, benzaldehyde and ethylene, pyruvate or pyruvate in the catalysis of enzyme in buffer solution reaction, purification, optically pure (S) - 1 3 phenyl 2 carbonyl optically pure alcohol; the 1 (S) 3 phenyl 2 carbonyl propanol and methylamine in catalysis of enzyme in buffer solution reaction (1S, 2S) 2 dimethylamino Phenylpropanes 1 alcohol, namely pseudoephedrine. The present invention is sufficient, the invention of raw material supply and low price, without preparation, inexpensive reagents, products can be easily purified by recrystallization, the cost is low; the direct catalytic conversion of bio enzyme production of pseudoephedrine, mild reaction conditions, suitable for industrial production; easy to control reaction conditions, convenient operation, simple process, no special requirements on the equipment suitable for mass production.

【技术实现步骤摘要】
伪麻黄碱的生物制备方法
本专利技术涉及原料药及药物中间体的制备方法，具体地指一种伪麻黄碱的生物制备方法。
技术介绍
草药麻黄有良好的药用价值，具有用药安全可靠、耐受性强、副作用小的优点。它的主要有效成分为麻黄碱和伪麻黄碱。伪麻黄碱为拟交感神经药，具有上呼吸道粘膜血管收缩作用、升压作用、并具有显著的利尿作用，还具有抗炎作用。与麻黄碱相比，其副作用小，用于治疗时，其加快心率、升高血压、中枢兴奋等不良反应较轻，并且具有显著的利尿、用药耐受性好等优点。临床上主要用于治疗感冒、枯草热、低血压、支气管哮喘、过敏性反应、鼻粘膜肿胀和其他上呼吸道变态反应等疾患。伪麻黄碱的生产，国内主要采用植物提取法，直接从麻黄草中提取麻黄碱。这种传统工艺工序繁琐，劳动强度大；生产成本高，直接依赖麻黄草资源，产量小且不稳定。此外，德国公司麻黄碱的生产直接用化学合成，先生产伪麻黄碱的外消旋体，需要进一步拆分，拆分试剂价格昂贵，成本高。利用生物转化法生产麻黄碱有许多优势，国内外报道一种半生物转化生产麻黄碱的方法，先用苯丙酮合成酶将苯甲醛转化为R-苯基乙酰基甲醇，再进一步化学合成麻黄碱，但产率不高。化学合成中还是要进行异构体拆分，从成本和环境保护考虑不利于实际生产，而国内外还未见报道利用酶催化直接生物转化生产麻黄碱的方法。因此，研发一种高效的利用酶催化直接生物转化生产伪麻黄碱的方法显得十分必要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题就是克服上述
技术介绍
的不足，提供一种伪麻黄碱的生物制备方法，该方法利用酶催化直接生物转化生产伪麻黄碱，在保证高转化率的基础上，简化生产工艺和降低生产成本。为解决上述技术问题，本专利技术所提供的伪麻黄碱的生物制备方法，其特征在于，包括式Ⅰ化合物苯甲醛、式Ⅳ化合物和甲胺在酶催化作用下在缓冲溶液中反应，纯化，得到式Ⅲ化合物(1S，2S)-2-甲氨基-苯丙烷-1-醇，即为伪麻黄碱；式Ⅳ化合物的化学式为其中，R选自H，COOH，COONa，COOK。优选地，伪麻黄碱的制备方法，包括两步，分别为：步骤1：式Ⅰ化合物苯甲醛和式Ⅳ化合物在酶的催化作用下在缓冲溶液中反应，纯化，得到光学纯的式Ⅱ化合物(S)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇；反应式如下：步骤2：步骤1所得的光学纯式Ⅱ化合物(S)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇与甲胺在酶的催化作用下在缓冲溶液中反应，得到含有式Ⅲ化合物(1S，2S)-2-甲氨基-苯丙烷-1-醇的转化液，纯化，得到式Ⅲ化合物(1S，2S)-2-甲氨基-苯丙烷-1-醇，即为伪麻黄碱；反应式如下：进一步地，步骤1中，酶为生物酶和辅酶，生物酶为苯丙酮合成酶，苯丙酮合成酶可以商业购买或是基因工程菌全细胞或粗酶液。辅酶为焦磷酸硫胺素，反应体系中添加MgCl2或MgSO4。进一步地，步骤1中，反应体系中还添加DMF和聚乙二醇，控制MgCl2的浓度为3-8mM，控制DMF的浓度为0.5-2mM，控制聚乙二醇的浓度为1-3mM。进一步地，步骤1中，生物酶为来源于巴氏醋杆菌的苯丙酮合成酶的基因工程菌全细胞，来源于巴氏醋杆菌的苯丙酮合成酶的基因工程菌中外源苯丙酮合成酶的编码基因是序列表中SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；控制来源于巴氏醋杆菌的苯丙酮合成酶的基因工程菌全细胞的浓度为50-100g/L，控制辅酶硫胺素焦磷酸的浓度为3-5mM。进一步地，步骤2中，酶为生物酶和辅酶，生物酶为N-甲基氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。进一步地，步骤2中，生物酶为来源于PseudomonasputidaATCC12633的N-甲基氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.47)，反应体系中加入葡萄糖，使用NADH或NAD+作为辅酶。由葡萄糖脱氢酶介导的辅酶循环再生体系是常规技术，通常包括葡萄糖、辅酶NADH或NAD+和葡萄糖脱氢酶，本领域的技术人员可以根据实际情况选择合适的组分和含量。葡萄糖脱氢酶可以商业购买或是基因工程菌全细胞或粗酶液。进一步地，步骤2中，生物酶为来源于PseudomonasputidaATCC12633的N-甲基氨基酸脱氢酶的基因工程菌全细胞和葡萄糖脱氢酶，所述来源于PseudomonasputidaATCC12633的N-甲基氨基酸脱氢酶的基因工程菌中外源N-甲基氨基酸脱氢酶的编码基因是序列表中SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；控制来源于PseudomonasputidaATCC12633的N-甲基氨基酸脱氢酶的基因工程菌全细胞的浓度为18-50g/L，所述步骤1和步骤2中，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的一种。进一步地，对含有式Ⅲ化合物(1S，2S)-2-甲氨基-苯丙烷-1-醇的转化液进行纯化，包括如下步骤：离心收集细胞，将上层清液用10M的NaOH溶液调节Ph至6.5-9，用旋转蒸发仪浓缩至体积至1/2，再用10M的HCl调节Ph至7，0-8℃下放置过夜，过滤收集形成的固体，将所得固体融入1M的NaOH溶液，再用10M的HCl调节Ph至7，用乙醇结晶，洗涤，真空干燥，得到伪麻黄碱或伪伪麻黄碱晶体。作为另一种技术方案，式Ⅰ化合物苯甲醛、式Ⅳ化合物和甲胺在苯丙酮合成酶，N-甲基氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶催化作用下，使用焦磷酸硫胺素和NADH作为辅酶在缓冲溶液中一锅法反应，得到含有式Ⅲ化合物(1S，2S)-2-甲氨基-苯丙烷-1-醇的转化液，纯化，得到式Ⅲ化合物(1S，2S)-2-甲氨基-苯丙烷-1-醇，即为伪麻黄碱。来源于巴氏醋杆菌的苯丙酮合成酶的基因工程菌，具体制备方法是：(1)构建含有苯丙酮合成酶基因的表达载体：提取巴氏醋杆菌的苯丙酮合成酶的基因组DNA作为模板，以包含NdeI和XhoI酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增：引物1:5’—GAATTCATATGACCTATACCGTGGGCATG—3’引物2:5’—GCCCTCGAGTTACGCCAGGGTGGTT—3’在上述引物的5’端的下划线部分分别引入NdeI酶切位点和XhoI酶切位点。PCR扩增体系为：基因组DNA2uL，引物1和引物2各2uL，dNTP4uL，10×Taq缓冲液5uL，Taq酶1uL，ddH2O34uL；PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，然后55℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸10min。(2)重组质粒的构建回收PCR扩增产物，经限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切，酶切体系为：PCR产物50uL，NdeI2.5uL，XhoI2.5uL，10×Taq缓冲液10uL，ddH2O35uL。将酶切后的PCR产物经过DNA纯化试剂盒纯化，与经过同样双酶切纯化的质粒pET-28a在T4连接酶的作用下进行连接，连接反应体系为：酶切纯化的PCR产物4uL，酶切纯化的pET-28a质粒4uL，T4连接酶1uL，10×T4连接酶缓冲液1uL。在16℃过夜连接，得到pET-28a重组质粒。(3)重组质粒转化至宿主细胞中将重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布在含有50ug/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养20-24h得到初步阳性克隆。(4)经抗性培养基筛选得到阳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种伪麻黄碱的生物制备方法，其特征在于，包括式Ⅰ化合物苯甲醛、式Ⅳ化合物和甲胺在酶催化作用下在缓冲溶液中反应，纯化，得到式Ⅲ化合物(1S，2S)‑2‑甲氨基‑苯丙烷‑1‑醇，即为伪麻黄碱；式Ⅳ化合物的化学式为

【技术特征摘要】
1.一种伪麻黄碱的生物制备方法，其特征在于，包括式Ⅰ化合物苯甲醛、式Ⅳ化合物和甲胺在酶催化作用下在缓冲溶液中反应，纯化，得到式Ⅲ化合物(1S，2S)-2-甲氨基-苯丙烷-1-醇，即为伪麻黄碱；式Ⅳ化合物的化学式为其中，R选自H，COOH，COONa，COOK。2.根据权利要求1所述的伪麻黄碱的制备方法，其特征在于，包括两步，分别为：步骤1：式Ⅰ化合物苯甲醛和式Ⅳ化合物在酶的催化作用下在缓冲溶液中反应，纯化，得到光学纯的式Ⅱ化合物(S)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇；反应式如下：步骤2：步骤1所得的光学纯式Ⅱ化合物(S)-1-苯基-2-羰基-3-丙醇与甲胺在酶的催化作用下在缓冲溶液中反应，得到含有式Ⅲ化合物(1S，2S)-2-甲氨基-苯丙烷-1-醇的转化液，纯化，得到式Ⅲ化合物(1S，2S)-2-甲氨基-苯丙烷-1-醇，即为伪麻黄碱；反应式如下：3.根据权利要求2所述的伪麻黄碱的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，酶为生物酶和辅酶，生物酶为苯丙酮合成酶，辅酶为焦磷酸硫胺素，反应体系中添加MgCl2或MgSO4。4.根据权利要求3所述的伪麻黄碱的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，反应体系中还添加DMF和聚乙二醇，控制MgCl2的浓度为3-8mM，控制DMF的浓度为0.5-2mM，控制聚乙二醇的浓度为1-3mM。5.根据权利要求4所述的伪麻黄碱的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，生物酶为来源于巴氏醋杆菌的苯丙酮合成酶的基因工程菌全细胞，来源于巴氏醋杆菌的苯丙酮合成酶的基因工程菌中外源苯丙酮合成酶的编码基因是序列表中SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；控制来源于巴氏醋杆菌的苯丙酮合成酶的基因工程菌全细胞的浓度为50-100g/L，控制辅酶硫胺素焦磷酸的浓度为3-5mM。6.根据权利要求5所...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡磊，奚超群，曾超，
申请(专利权)人：武汉茵茂特生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42