八棱丝瓜蛋白１及其编码基因，涉及生物化学中一种核糖体失活蛋白。本发明专利技术公开了从八棱丝瓜（Ｌｕｆｆａ ａｃｕｔａｎｇｕｌａ）种子中提取的一种核糖体失活蛋白－八棱丝瓜蛋白１（Ｌｕｆｆａｃｕｌｉｎ １）的成熟蛋白的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列。一级结构和晶体结构分析表明它是类型１核糖体失活蛋白，具有抗肿瘤，抗病毒，特别是抗艾滋病毒作用，为获得药用蛋白质或制备免疫毒素提供关键技术。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化学领域，特别是涉及到生物化学中一种核糖体失活蛋白 一-八棱丝瓜蛋白l及其编码基因与其在制备抗肿瘤，抗病毒，特别是抗艾滋病 毒的药物中的应用。技术背景从高等植物中提取的核糖体失活蛋白(Ribosome-Inactivating Protein, 简称RIP)，核糖体失活蛋白是一类能使真核生物细胞的核糖体失活，从而抑 制细胞内蛋白质合成的细胞毒素，其作用机制是具有RNA N-糖苷酶或叫多核苷 酸'腺苷糖苷酶活性。根据蛋白分子及其基因的结构，RIP可以分 为3类，类型l RIP是具RNA N-糖苷酶活性的单肽链蛋白，例如，来自葫芦科 植物栝楼块根的天花粉蛋白(Trichosanthin，简称TCS)，白泻根蛋白 (Bryodin，简称BRY),苦瓜种子的a ， 0 _苦瓜蛋白(a ， p -Momorcharin，简 称MMA，MMB)和丝瓜(Luffa cylindrica)种子的丝瓜蛋白a, b (Luffin a， b简称LUA,LUB)。类型2 RIP是双肽链蛋白，例如，来自大戟科植物蓖麻种 子的蓖麻毒素(Ricin)和豆科植物相思树种子的相思子毒素(Abrin)，它是由 一条具有RNA N-糖苷酶活性的A链和一条具凝集素活性的B链通过二硫键连接 而成的。类型3 RlP是一类茉莉酮诱导的蛋白(jasmonate-induced protein), 它是由具有RNA N-糖苷酶功能的N端结构域和一个未知功能的C端结构域组成， 例如来自大麦的JIP60。从葫芦科植物中分离出来的类型1核糖体失活蛋白，例 如天花粉蛋白、苦瓜蛋白、丝瓜蛋白、白泻根蛋白等，均具有抗肿瘤，抗病毒活 性，特别是抗艾滋病毒活性。葫芦科丝瓜属植物主要有两个栽培种， 一是普通丝瓜(Luffa cylindricalRoem.或Luffa aegyptiaca Mill.)， 一般就叫丝瓜(中国植物志，中国高等植 物图鉴)；一是八棱丝瓜(Luffa acutangula Roxb.)，又叫棱角丝瓜(中国高等 植物图鉴)，广东丝瓜(中国植物志)。ZL97112602.X提供了从八棱丝瓜种子中分 离出的类型l RIP——八棱丝瓜蛋白l (Luffaculin 1,简称LAl)，并公开了 它的制备方法。SDS-PAGE显示它的分子量为28kDa，其N端氨基酸顺序为 Asp-Val-Ser-Phe-Ser，具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成的活性。 CN1473847A提供了八棱丝瓜蛋白1的等电点、二级结构、糖苷酶活性和抗肿瘤 活性及其应用。林峻凯等(林峻凯，陈明晃，谢捷明，等，八棱丝瓜籽核糖体失活蛋白的 分离纯化及其理化性质，中国生物化学与分子生物学报，2002， 18， 609 — 613)，从八棱丝瓜种子中提取到八棱丝瓜蛋白1，测定其分子量为28kD，等电 点为8.86，具有RNA N—糖苷酶活性，细胞对蛋白质合成有抑制活性，及体外 对肿瘤细胞较强的抑制活性，认为可以用于或构成免疫毒素治疗癌症。陈明晃 等人(陈明晃，石小莉，叶晓明，等，八棱丝瓜蛋白1的二级结构及其生物活 性，结构化学，2004， 23， 232-236)报道了八棱丝瓜蛋白1的N端顺序， 用CD谱测定二级结构及对肿瘤细胞的抑制活性。陈明晃等人(ChenMH, Ye XM, Shi XL， et al: Uiffaculins， ribosome-inactivating protein from the seeds of Luffa acutangula . TOXICOLOGY. 2003,191 48)报道了八棱丝瓜蛋白 1的抗肿瘤活性。谢捷明等(谢捷明，陈明晃，许盈，等，八棱丝瓜蛋白1对 B16细胞的诱导分化作用， 2005, 12, 1521-1524)报道了八棱丝瓜蛋白1对B16 细胞的诱导分化作用。侯晓敏等(Hou XM, Chen MH, Xie JM， et al: Crystallization and preliminary crystallogr即hic studies of luffaculin 1， a ribosome-inactivating protein from the seeds of Uiffa acutangula)报道了八棱丝瓜蛋白1的初步结晶学研究。上述专利和文献表明，提取自八棱丝瓜种子的核糖体失活蛋白一八棱丝瓜 蛋白1，是类型1核糖体失活蛋白，具有抗肿瘤，抗病毒作用等多种生物学功能， 尤其八棱丝瓜蛋白1具有较强的抗肿瘤活性，并报道了八棱丝瓜蛋白1的诱导 肿瘤细胞分化的作用，促使我们进一步了解八棱丝瓜蛋白1的一级结构和空间 结构及其基因，阐明八棱丝瓜蛋白1的结构与功能，研究基因的表达、调控， 开展蛋白质工程和基因工程，并为获得药用蛋白质或制备免疫毒素提供基础知 识。
技术实现思路
本专利技术的目的是基于上述现有技术基础，提供一种核糖体失活蛋白—八棱 丝瓜蛋白1的成熟蛋白的全长氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列。通过一 级结构比较分析和晶体结构(三级结构)的分析，为制备抗肿瘤，抗病毒，特 别是抗艾滋病病毒的药物和制备免疫毒素提供关键技术。本专利技术提纯了八棱丝瓜蛋白1 (Luffaculin 1,简称LA1)，并在生物质谱 仪上测定了它的精确分子量为27960Da(ESI-MS测定)，或27893 Da (MALDI-TOF-MS测定)。本专利技术从八棱丝瓜种子发芽后长出来的第一片真叶，按天根公司的植物基 因组DNA提取试剂盒说明书上操作要求，提取八棱丝瓜总的DNA。本专利技术根据八棱丝瓜蛋白1的N端氨基酸顺序(DVSFSLS)设计寡核苷酸上 游引物(5， -GATGTGAGCTTCAGTTTGTC-3，)，并根据八棱丝瓜蛋白1的晶体学判 断C端氨基酸顺序(NIQLLLN )设计寡核苷酸的下游引物 (5' -TTTAGAAGCAATGGATGT-3， )。 PCR扩增反应程序为首先模板 94。C变性2min，然后进行35个循环包括94。C变性50s， 49。C退火45s， 72。C延伸lmin30s，最后再延伸10min结束PCR反应。按照《精编分子生物学试验指南》 (北京科学出版社，1998)中的操作说明进行琼脂糖凝胶电泳及DAN片段回 收.测序公司测定核苷酸顺序.上述方法获得的八棱丝瓜蛋白1 DNA基因序列，见序列表SEQ ID No:2。结合八棱丝瓜蛋白1DNA基因顺序所推断出的氨基酸顺序、八棱丝瓜蛋白1 的晶体学研究判断出来的C端顺序，获得了八棱丝瓜蛋白1的成熟蛋白的全长 氨基酸序列，见序列表SEQ ID No:l。将八棱丝瓜蛋白1全长氨基酸序列与已报道的2种丝瓜蛋白a (Luffin a) (一是LUA: SwissPort蛋白数据库登陆号为:Q00465, gil32590; 一是LUS: 即由CN1763087A提供的luff in a的242个氨基酸序列)进行序列同源性比较， LAI与LUA只有5个残基不同，LAI与LUS有5个残基不同(不包括LUS的C端 缺少的5个残基)，见图l。比较表明这三者之间同源性很强，但由于来源于不 同的种而有所差别。将八棱丝瓜蛋白1全长氨基酸序列与已报道的几种具有抗肿瘤，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从八棱丝瓜（Ｌｕｆｆａ ａｃｕｔａｎｇｕｌａ）种子中提取的核糖体失活蛋白－八棱丝瓜蛋白１，其特征在于，具有序列表中的ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１氨基酸残基序列的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈明晃，侯晓敏，
申请(专利权)人：中国科学院福建物质结构研究所，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]
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