猪繁殖与呼吸综合症灭活浓缩疫苗“SD1株”的制备方法技术

本发明专利技术提供一种猪繁殖与呼吸综合症灭活浓缩疫苗“ＳＤ１株”的制备方法，该疫苗是由水相和油相按下述重量百分比含量配制而成：水相，由灭活２０小时、浓缩２倍的美洲型猪繁殖与呼吸综合症病毒“ＳＤ１株”培养液９６份，加入４份吐温－８０，充分混匀而成，水相占疫苗总量的３３％；油相，由９４份１０号白油和６份司本－８０混合，再按总量加入２％硬脂酸铝搅拌至透明，于１１６℃高压灭菌制成，油相占疫苗总量的６７％。本疫苗保存期达１２个月，对猪繁殖与呼吸综合症易感动物安全可靠，适用于不同品种、各种日龄猪，免疫保护率达８０％以上，免疫有效期持续６个月以上。疫苗安全性和免疫效力达国际同类产品先进水平。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及兽医生物制品中猪繁殖与呼吸综合症疫苗领域，具体是猪繁殖 与呼吸综合症灭活浓縮疫苗"SD1株"的制备方法。2、
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合症(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，俗称"蓝耳病"，是上世纪80年代末出现的一种新的猪病毒性传染病。 病原PRRS病毒(PRRSV)为有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组长度约为15Kb， 含有9个开放阅读框(ORFs) 。 PRRSV可侵害各年龄阶段的猪，造成种猪精液质 量下降，母猪流产、返情、产死胎或弱仔、仔猪死亡及各种年龄猪不同程度的 呼吸道症状。PRRS现已遍布全球，成为当前危害国内外养猪业最为严重的疫病 之一。另外，PRRSV能够侵害猪的免疫系统，引起免疫抑制， 一旦感染将影响到 其它疫苗的免疫效果，造成免疫失败。在养猪生产中，PRRS与其他病毒或细菌 性疾病的混合感染非常普遍，引起的临床症状更为复杂，给本病的诊断和综合 防治带来更大难度。我国于1995年底爆发此病，并迅速蔓延到全国多个省份，在许多规模化猪 场，PRRS阳性率很高，有的可达80%以上，感染十分普遍，造成母猪繁殖水平 不高，产仔率和仔猪成活率远远低于正常水平。自2006年6月初以来，在我国 南方几个省份相继爆发高致病性猪蓝耳病，引起大批生猪发病或死亡，使我国 的养猪业蒙受了更为严重的经济损失，造成目前猪肉价格长时间居高不下，已 经引起了政府和社会上的高度关注。选择压力导致近年来我国不同地区的PRRSV流行株呈较大的遗传及抗原变 异，PRRS在一些地区未能得到有效控制。疫苗免疫是预防PRRS积极有效的措施 之一，目前PRRS疫苗包括弱毒疫苗和灭活疫苗两种，弱毒疫苗因其安全性问题 备受争议，丹麦曾经因使用弱毒疫苗而导致大面积爆发蓝耳病，造成严重的经 济损失。普通灭活疫苗虽然安全性较高，但往往由于抗原含量不足而无法发挥 有效的免疫保护作用。因此研发交叉保护性好、免疫原性强、安全性高的PRRS 疫苗是当前预防和控制PRRS的迫切需要。3、
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可预防PRRS的安全、高效、可靠的猪繁殖与呼吸 综合症灭活浓縮疫苗"SD1株"的制备方法，用于PRRS的免疫预防和紧急接种。本专利技术的目的猪繁殖与呼吸综合症灭活浓縮疫苗"SD1株"的制备方法是 按以下方式实现的。本专利技术的猪繁殖与呼吸综合症灭活浓縮疫苗"SD1株"是由水相和油相按 下述重量百分比含量配制而成水相是由灭活20小时、浓縮2倍的美洲型猪繁 殖与呼吸综合症"SD1株"病毒培养液96份，加入4份吐温-80，充分混匀而成， 水相占疫苗总量的33%;油相，由94份10号白油和6份司本-80混合，再按总 量加入2%硬脂酸铝搅拌至透明，于116。C高压灭菌制成，油相占疫苗总量的67%。上述含量原料按照下述工艺方法和顺序制备而成a、 生产用毒种制备；b、 病毒增殖； C、病毒灭活；d、 病毒浓縮；e、 半成品检验，包括l)无菌检验；2)灭活检验；f、 疫苗配制程序先配制油相，将94份10号白油和6份司本-80混合，再按总量加入2%硬脂酸铝随加随搅拌至透明为止，116t:高压灭菌后，取占疫苗总量67%的油相加入胶体磨中，开动电机慢速转动搅拌，在搅动油相的同时，缓 慢地加入占疫苗总量33%的水相，加完后再以10000r/min搅拌3-5min，在终止 搅拌前加入0.01%硫柳汞。水相由灭活20小时、浓縮2倍的美洲型猪繁殖与呼 吸综合症病毒"SD1株"培养液96份，加入4份吐温-80，充分混匀而成。g、 成品检验，包括l)物理性状；2)无菌检验；3)甲醛、硫柳汞含量测定；4)安全检验；5)效力检验包装既为成品。在对PRRSV "SD1株"细胞培养生物学特性研究的基础上，我们对PRRS灭 活疫苗生产工艺进行了研究，包括毒种标准及毒种繁殖、病毒增殖、病毒灭活、 乳化工艺、安全检验等内容。将效价大于107°TCID5。/mL的病毒液用终浓度为0. 1% 的甲醛于37。C灭活20h，加入4%吐温-80，然后用美国PALL浓縮仪将病毒浓縮 2倍作为水相，与油相(按油水比2: l的比例)于胶体磨中乳化而成。疫苗性 状为油包水型，对不同品种、各种日龄猪安全可靠，无毒副作用及不良反应。 仔猪免疫剂量为2ml/头，成年猪免疫剂量为4ml/头。仔猪与母猪注射PRRS疫 苗后能够产生较强的免疫力，免疫保护率达80%以上。仔猪经过一次免疫，母猪经过两次免疫后，在免疫2个月后中和抗体水平达到最高峰，免疫有效期达6个月以上。2 8'C条件下疫苗保存期暂定为12个月。疫苗安全性和免疫效力达 到国际同类产品先进水平。选用3批猪繁殖与呼吸综合症油乳剂灭活疫苗"SD1 株"进行田间试验，免疫接种了 662头母猪，6844头仔猪，随后在GMP车间中 间试制了 6批PRRS灭活疫苗"SD1株"，共免疫成年猪2200头，仔猪20000余 头，结果证明疫苗安全可靠，效力确实，有着广阔的应用前景。 具体实施方式猪繁殖与呼吸综合症灭活浓縮疫苗"SD1株"的制备方法，具体制备步骤 如下由水相和油相按下述重量百分比含量配制而成水相，由灭活20小时、 浓縮2倍的美洲型猪繁殖与呼吸综合症病毒"SD1株"培养液96份，加入4份 吐温-80，充分混匀而成，水相占疫苗总量的33%;油相，由94份10号白油和 6份司本-80混合，再按总量加入2%硬脂酸铝搅拌至透明，于116'C高压灭菌制 成，油相占疫苗总量的67%。以上原料按照下述工艺方法和顺序实现。1)、毒种选择制苗用毒种为猪繁殖与呼吸综合症病毒PRRSV "SD1株"，美洲型(B型)。 将PRRSV "SD1株"以含2.5y。小牛血清的MEM作十倍递进稀释，取10—3，10—4，…， 10 8 6个稀释度，分别接种已经长成单层的Marc-145细胞，每个稀释度接种8 孔，0. lmL/孔，同时设不接毒对照，连续观察5-7d，记录每个稀释度出现CPE 的孔数。按Reed-Muench法计算半数细胞培养物感染量(TCID5。)，每毫升病毒 含量应》1()7。TCID5。。 2)病毒增殖2.1制苗材料的制备将MEM配制成除菌滤过溶液，以7.5y。NaHC03调pH至 7.2-7.4，加入8%新生牛血清、100p/mL青霉素和链霉素，混匀，配制成生长液。 维持液的血清含量为2.5%，其他成分与牛长液相同。取长成单层的Marc-145细 胞，倾去生长液，加入适量0.025y。胰蛋白酶与EDTA消化分散液(pH7.6-8.0)， 于37'C消化至贴壁细胞分散，倒去残余液后加入生长液进行吹打、分散细胞。 然后调整细胞密度为10-15万/mL，分装后置37"C培养，转瓶培养时转速为6-8转， 约48h形成细胞单层。2.2病毒接种将细胞瓶内的生长液弃去，接种1% PRRSV "SD1株"，37 "C吸附30min。然后加入维持液，置37'C继续培养。每天观察细胞变化与CPE情 况，当CPE达8(m左右时收毒。反复冻融3次后混匀病毒悬液，抽取小样，用96孔细胞培养板测定，病毒含量应》10"TCID5。/mL。置-2(TC保存。3) 病毒灭活向病毒液中加入终浓度为O. 1%的本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪繁殖与呼吸综合症灭活浓缩疫苗“ＳＤ１株”的制备方法，其特征在于由水相和油相按３３％∶６７％重量百分比配制而成：其中水相，是由灭活２０小时、浓缩２倍的美洲型猪繁殖与呼吸综合症“ＳＤ１株”病毒培养液９６份，加入４份吐温－８０，充分混匀而成；水相占疫苗总量的３３％；油相，是由９４份１０号白油和６份司本－８０混合，再按油相总量加入２％硬脂酸铝搅拌至透明，于１１６℃高压灭菌制成，油相占疫苗总量的６７％；制备步骤如下：ａ生产用毒种制备；制苗用毒种为猪繁殖与呼吸综合症病毒 ＰＲＲＳＶ“ＳＤ１株”，美洲型（Ｂ型），将ＰＲＲＳＶ“ＳＤ１株”以含２．５％小牛血清的ＭＥＭ作十倍递进稀释，取１０↑［－３］，１０↑［－４］，…，１０↑［－８］６个稀释度，分别接种已经长成单层的Ｍａｒｃ－１４５细胞，每个稀释度接种８孔，０．１ｍＬ／孔，同时设不接毒对照，连续观察５－７ｄ，记录每个稀释度出现ＣＰＥ的孔数，按Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法计算半数细胞培养物感染量（ＴＣＩＤ↓［５０］），每毫升病毒含量应≥１０↑［７．０］ＴＣＩＤ↓［５０］；ｂ、病毒增殖和制苗材料的 制备：将ＭＥＭ配制成除菌滤过溶液，以７．５％ＮａＨＣＯ↓［３］调ｐＨ至７．２－７．４，加入８％新生牛血清、１００μ／ｍＬ青霉素和链霉素，混匀，配制成生长液，维持液的血清含量为２．５％，其他成分与生长液相同，取长成单层的Ｍａｒｃ－１４５细胞，倾去生长液，加入适量０．０２５％胰蛋白酶与ＥＤＴＡ消化分散液（ｐＨ７．６－８．０），于３７℃消化至贴壁细胞分散，倒去残余液后加入生长液进行吹打、分散细胞，然后调整细胞密度为１０－１５万／ｍＬ，分装后置３７℃培养，转瓶培养时转速为６－８转，约４８ｈ形成细胞单层；ｃ、病毒接种：将细胞瓶内的生长液弃去，接种１％ＰＲＲＳＶ“ＳＤ１株”，３７℃吸附３０ｍｉｎ，然后加入维持液，置３７℃继续培养，每天观察细胞变化与ＣＰＥ情况，当ＣＰＥ达８０％左右时收毒，反复冻融３次后混匀病毒悬 液，抽取小样，用９６孔细胞培养板测定，病毒含量应≥１０↑［７．０］ＴＣＩＤ↓［５０］／ｍＬ。置－２０℃保存；ｄ、病毒灭活；向病毒液中加入终浓度为０．１％的甲醛溶液，充分混匀后置３７℃灭活２０ｈ，其间每隔４－６ｈ摇动病毒悬液一次，并更 换瓶塞；ｅ、病毒浓缩；采用美国ＰＡＬＬ浓缩仪将灭活后的病毒浓缩２倍；ｆ、半成品检验１）无菌检验：对灭活病毒液按《中国兽药典》附...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王金宝，吴家强，张秀美，李俊，任慧英，温建新，周顺，徐龙涛，禚宝山，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]