产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖、提取及抗感染应用制造技术

本发明专利技术公开了产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖、提取及抗感染应用，所述肽聚糖从产丙酮酸棒状杆菌的细胞壁通过三氯乙酸法提取而得，所述产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖在抗革兰氏阳性菌感染或/和抗真菌感染上的应用。本发明专利技术所提供的单纯肽聚糖的作用可以减少产丙酮酸棒状杆菌全菌体的副作用；所提取的产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖（CP‑PGN）一定程度上可以延长感染小鼠的生存时间及增强其抗感染能力，对其感染具有良好的预防效果；另外，CP‑PGN能够阻止局部感染进展为系统感染，可有效的阻止感染范围的扩大；此外，在低剂量感染时，CP‑PGN还表现出与万古霉素（VA）相似的感染治疗效果，可作为一种抗生素万古霉素的替代品，临床应用前景良好。

The application of Corynebacterium pyruvate with peptidoglycan, extraction and anti infection

The invention discloses a production of pyruvic acid Corynebacterium peptidoglycan, extraction and application of anti infection, the cell wall peptidoglycan from Corynebacterium producing pyruvic acid by three trichloroacetic acid extraction and the production of pyruvic acid, Corynebacterium peptidoglycan in application of anti gram positive bacteria infection or / and anti fungi. The pure peptidoglycan provided by the invention can reduce the side effect of the role of pyruvate production of Corynebacterium whole cell extract; producing pyruvic acid Corynebacterium peptidoglycan (CP PGN) to a certain extent can prolong the survival time of the infected mice and enhance the ability of anti infection, has a good effect on the prevention of the infection; in addition, CP PGN can prevent local infection in systemic infection can effectively prevent infection, expand the range; in addition, the low dose of infection, CP PGN also exhibited with vancomycin (VA) infection treatment effect is similar, can be used as a substitute for antibiotics vancomycin, good clinical application prospect.

【技术实现步骤摘要】
产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖、提取及抗感染应用
本专利技术属于生物
，具体涉及产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖、提取及抗感染应用。
技术介绍
产丙酮酸棒状杆菌（CP）是近年来新发现的一种棒状杆菌，研究表明CP能增加抗原的免疫原性和反应原性，促进树突状细胞的成熟和抗原提呈能力，具有一定的免疫调节作用，作为免疫调节剂，显示了良好的应用前景，然而产丙酮酸棒状杆菌作为一种菌体，其全菌体在实际应用过程中会产生一定副作用。细菌细胞壁的共有成分-肽聚糖（PGN）也是一种较强的免疫增强剂，具有多种生物学活性，能刺激单核巨噬细胞和内皮细胞释放免疫调控物质，在调节宿主免疫功能方面发挥着重要作用，具有很好的研究和应用价值。通常，细菌肽聚糖的提取方法主要是三氯乙酸法，但是由于不同细菌的肽聚糖的含量和结构不同，因此不同细菌肽聚糖提取过程中最佳的步骤顺序、试剂配比会有所不同，不同的方法提取的肽聚糖的得率、结构完整性也不相同，从而导致其发挥的作用及实际应用也存在一定的差别。因此，对不同细菌来源的肽聚糖，应当找到适合的肽聚糖提取方法以及探讨其合适的实际应用。专利CN103981232A公开了一种功能性嗜酸乳杆菌肽聚糖，此研究表明该嗜酸乳杆菌肽聚糖能降低大肠杆菌脂多糖引起的炎症反应，为乳酸菌调节肠道免疫活性，调控相关免疫因子的释放来刺激免疫系统发挥其抗感染作用，开发乳酸菌新型保健因子、功能性食品或药品提供理论依据。然而，现有技术中，还未发现针对产丙酮酸棒状杆菌的肽聚糖（CP-PGN）的提取及其应用的研究。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术针对以上至少一种技术问题，提供一种产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖、提取及应用，并通过验证肽聚糖的纯度，分析其结构以及构建其抗感染动物模型，对所提取的产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的抗感染应用进行研究。本专利技术采用的一种技术方案为：产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的抗感染应用，所述肽聚糖从产丙酮酸棒状杆菌的细胞壁通过三氯乙酸法提取而得，所述肽聚糖的重均分子量Mw为18774Da，所述产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖在抗革兰氏阳性菌感染或/和抗真菌感染上的应用。具体的，所述产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖可制作成相应的抗感染的药物制剂或饲料、保健品、食品等日化添加剂的应用。上述的产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的抗感染应用，所述产丙酮酸棒状杆菌的菌种编号为ATCCBAA-1742或CCUG57046。上述的产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的抗感染应用，所述革兰氏阳性菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。上述的产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的抗感染应用，所述真菌为白色念珠菌。上述的产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的抗感染应用，所述产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的提取步骤包括：收集产丙酮酸棒状杆菌菌体，先用10%的三氯乙酸溶液去除磷壁酸，再用8g/dl的SDS溶液和1mg/ml的胰蛋白酶缓冲液中去除蛋白质，最后用乙醚去除脂类，即得。上述的产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的抗感染应用，所述去除蛋白质的具体步骤包括：先加入8g/dl的SDS溶液中并于沸水中搅拌，离心取沉淀后再加入1mg/ml的胰蛋白酶缓冲液震荡均匀，随后先低速离心取上清液，再高速离心取沉淀即可。本专利技术采用的另一种技术方案为：产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的提取，所述肽聚糖的提取步骤为：（1）产丙酮酸棒状杆菌菌体的收集挑取单个产丙酮酸棒状杆菌菌落接种于含植物油的LB培养液中进行摇菌，培养，离心收集菌体，洗涤至菌体呈乳白色，得到湿菌体；（2）产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的提取采用三氯乙酸法进行肽聚糖的提取，其具体步骤为：a.去除磷壁酸取收集到的上述湿菌体，按1克重量份湿菌体与10毫升体积份10%的三氯乙酸溶液均匀混合后，边搅拌边沸水浴；离心，弃去上清；最后洗涤沉淀，即获得不含磷壁酸的沉淀物I；b.去除蛋白质按1克重量份步骤a中所得沉淀物I与10毫升体积份8g/dl的SDS溶液均匀混合后，边搅拌边沸水浴；离心，弃去上清；再用洗涤沉淀；将洗涤后的沉淀按1克重量份与0.5毫升体积份的1mg/ml的胰蛋白酶缓冲液混匀，振荡均匀；低速离心并收集上清液，将该上清液高速离心后收集沉淀物II；c.去除脂类将步骤b所得沉淀物II悬浮于乙醚中，室温下静置，再于高速离心后收集沉淀；用无水乙醇脱水，于烘箱内干燥后即可得到褐色胶质肽聚糖产物。上述的产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的提取，所述肽聚糖的具体提取步骤为：（1）产丙酮酸棒状杆菌菌体的收集挑取单个产丙酮酸棒状杆菌菌落接种于含5%植物油的LB培养液中进行摇菌，两天后4000r/min离心10min收集菌体，用生理盐水反复洗涤至菌体呈乳白色，得到湿菌体；（2）产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的提取采用三氯乙酸法进行肽聚糖的提取，其具体步骤为：a.去除磷壁酸取收集到的上述湿菌体，按1克重量份湿菌体与10毫升体积份10%的三氯乙酸溶液均匀混合后，边搅拌边沸水浴20min；4000r/min离心10min，弃去上清；最后用灭菌蒸馏水3次洗涤沉淀，即获得不含磷壁酸的沉淀物I；b.去除蛋白质按1克重量份步骤a中所得沉淀物I与10毫升体积份8g/dl的SDS溶液均匀混合后，边搅拌边沸水浴30min；通过4000r/min离心30min，弃去上清；再用灭菌蒸馏水4次洗涤沉淀；将洗涤后的沉淀按1克重量份与0.5毫升体积份的1mg/ml的胰蛋白酶缓冲液混匀，37°C振荡3h；3h后在4°C，3000r/min离心5min；收集上清液，该上清液在12000r/min离心15min后收集沉淀物II；c.去除脂类将步骤b所得沉淀物II悬浮于乙醚中，室温下静置30min，再于12000r/min离心15min后收集沉淀；用无水乙醇脱水，于70°C烘箱内干燥后即可得到褐色胶质肽聚糖产物。本专利技术采用的又一种技术方案为：产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖，所述肽聚糖由以上所述的提取方法提取而得。本专利技术的有益效果：1）单纯肽聚糖的作用可以减少全菌体的副作用，同时为产丙酮酸棒状杆菌的功能研究提供一定的基础。2）产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖（CP-PGN）可在一定程度上可以延长感染小鼠的生存时间及增强其抗感染能力，对其感染具有良好的预防效果。试验结果显示CP-PGN对MRSA、白色念珠菌和肺炎克雷伯菌感染均具有良好的抑制作用，尤其对于抗MRSA和白色念珠菌的感染效果更为显著。3）CP-PGN能够阻止MRSA的局部感染进展为系统感染，可有效的阻止感染范围的扩大，提高预防和治疗效果。4）CP-PGN表现出与万古霉素（VA）相似的感染治疗效果。如此在小剂量感染时，CP-PGN可作为一种抗生素万古霉素的替代品，可减少抗生素万古霉素的使用量，提高人体用药健康。5）CP-PGN与万古霉素（VA）联合治疗可以提高生存率和改善生存状态，如此在大剂量感染时，可配合万古霉素使用，提高治疗效果和治愈率。附图说明图1为本专利技术产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的傅里叶红外光谱分析。图2为本专利技术产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的相对分子量测试图谱。图3为溶菌酶对本专利技术产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖分解的吸光度-时间曲线图。图4为本专利技术产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的抗MRSA/白色念珠菌/肺炎克雷伯菌血流感染动物模型的对比生存曲线。图5为本专利技术产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的抗MRSA/白色念珠菌/肺炎克雷伯菌血流感染动物模型的对比脾脏重量图和对比脾脏体积参数图。图6为本专利技术产丙酮酸棒状杆菌肽本文档来自技高网...

【技术保护点】
产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的抗感染应用，其特征在于，所述肽聚糖从产丙酮酸棒状杆菌的细胞壁通过三氯乙酸法提取而得，所述肽聚糖的重均分子量Mw为18774Da，所述产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖在抗革兰氏阳性菌感染或/和抗真菌感染上的应用。

【技术特征摘要】
1.产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的抗感染应用，其特征在于，所述肽聚糖从产丙酮酸棒状杆菌的细胞壁通过三氯乙酸法提取而得，所述肽聚糖的重均分子量Mw为18774Da，所述产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖在抗革兰氏阳性菌感染或/和抗真菌感染上的应用。2.根据权利要求1所述的产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的抗感染应用，其特征在于，所述产丙酮酸棒状杆菌的菌种编号为ATCCBAA-1742或CCUG57046。3.根据权利要求1所述的产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的抗感染应用，其特征在于，所述革兰氏阳性菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。4.根据权利要求1所述的产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的抗感染应用，其特征在于，所述真菌为白色念珠菌。5.根据权利要求1所述的产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的抗感染应用，其特征在于，所述产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的提取步骤为：收集产丙酮酸棒状杆菌菌体，先用10%的三氯乙酸溶液去除磷壁酸，再用8g/dl的SDS溶液和1mg/ml的胰蛋白酶缓冲液去除蛋白质，最后用乙醚去除脂类，即得。6.根据权利要求5所述的产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的抗感染应用，其特征在于，所述去除蛋白质的具体步骤包括：先加入8g/dl的SDS溶液中并于沸水中搅拌，离心取沉淀后再加入1mg/ml的胰蛋白酶缓冲液震荡均匀，随后先低速离心取上清液，再高速离心取沉淀即可。7.产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的提取，其特征在于，所述肽聚糖的提取步骤为：（1）产丙酮酸棒状杆菌菌体的收集挑取单个产丙酮酸棒状杆菌菌落接种于含植物油的LB培养液中进行摇菌，培养，离心收集菌体，洗涤至菌体呈乳白色，得到湿菌体；（2）产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的提取采用三氯乙酸法进行肽聚糖的提取，其具体步骤为：a.去除磷壁酸取收集到的上述湿菌体，按1克重量份湿菌体与10毫升体积份10%的三氯乙酸溶液均匀混合后，边搅拌边沸水浴；离心，弃去上清；最后洗涤沉淀，即获得不含磷壁酸的沉淀物I；b.去除蛋白质按1克重量份步骤a中所得沉淀物I与10毫升体积份8g/dl...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩清珍，史进方，章杨，
申请(专利权)人：苏州大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32