本发明专利技术是一种肽聚糖免疫增强剂。其色泽为淡褐色，粘度：３．２－５．０，比重：１．０２１－１．０４２；其含：１．５－２．０％的活性成分肽聚糖，５－８％的蛋白质，０．３－０．５％的脂肪，０．０１－０．０２％的核糖核酸，８－１０％的总固形物，其余为：水。该免疫增强剂的生产方法如下：经培养菌种接种一级种子培养－二级种子罐厌氧培养；即可接种于初始发酵罐，并在发酵过程中每间隔２小时通入适量氮气；在菌液ＯＤ值１．０－１．４时终止发酵；再接种于ｎ个发酵罐，继续培养，当发酵液ＯＤ值在１．０－１．４时，以此发酵液为目的发酵液；再经分离取菌体，再转至后处理罐，加入消化缓冲液行菌体后处理，再加入溶菌酶消化处理，再加入半胱氨酸并补充ＥＤＴＡ处理，之后加入木瓜蛋白酶消化处理；最终获得上述组分的液体肽聚糖制剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及产业化生产养殖鱼虾饲料添加剂技术的改进，具体讲是一种。本专利技术利用微生物发酵技术，产业化生产鱼虾饲料用多糖类免疫增强剂。
技术介绍
在当前的水产养殖中，普遍存在过度追求产量、忽视质量的现象。结果导致养殖密度过大，水质污染加重，从而造成病害时常发生，特别是近几年来，水产养殖动物中病毒病大规模暴发，给水产养殖业造成了巨大损失。因此，控制疾病的发生对水产养殖业可持续发展具有重要意义。在水产病害防治领域中，传统上是采用抗生素来预防和控制病害的发生。这样的传统做法存在诸多弊端，如滥用抗生素而造成抗生素污染，进而使病害生物产生抗药性，或者由于滥用药物，而造成药物残留超标等负面效应。单纯靠抗生素药物对防治病毒病是根本没有效果的。再众所周知，接种疫苗是水产养殖中预防疾病的有效措施，可是由于免疫反应具有特异性，一种疫苗只能特异性地预防相应的某种疾病，而且由于现阶段疫苗的制备及其在实际生产中的广泛应用仍存在着困难。有一种肽聚糖广泛存在于部分革兰氏阴性菌和大部分革兰氏阳性菌细胞壁中，其是由聚糖链、肽亚单位和间肽桥组成的大分子聚合物。例如，双歧杆菌细胞壁肽聚糖含量约为细胞壁干重的50-80％，这种肽聚糖能对鱼类和对虾免疫系统产生免疫调节作用。低剂量肽聚糖的多种有益的生物学功能越来越引起人们的重视，特别是其免疫调节功能逐渐被人们所利用。由于自然界中菌种的多样性，组成其细胞壁的肽聚糖的结构也不尽相同，也决定了提取的肽聚糖的活性的差异较大，同样，不同的菌种单位发酵液中细菌产量高低也不尽相同。鱼虾用肽聚糖免疫增强剂的生产目前仅限于实验室小规模生产，其成本高，产品批次之间质量相差较大，而且整体质量不稳定。在水产养殖中，有关免疫激活剂的研究与应用，在国际上目前都还处在初始阶段，许多技术不成熟，且缺乏有效的技术指标来评价其应用的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的就是要应用发酵工艺、酶工程等生物技术，进行鱼虾肽聚糖免疫增强的产业化生产，可以实现减少污染、提高效率、降低成本、提高质量，利于肽聚糖制剂进一步在养殖生产中的广泛利用，提供一种成本更低的产业化生产鱼虾用肽聚糖免疫增强剂的技术。本专利技术的目的是由以下技术方案实现的，研制了一种肽聚糖免疫增强剂。所述的免疫增强剂具有如下的物化参数，色泽为淡褐色的液体，粘度3.2-5.0，比重1.021-1.042；该免疫增强剂按W/V比含有相对分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.5-2.0％，分子量小于20KD的蛋白质5-8％，脂肪0.3-0.5％，核糖核酸0.01-0.02％，总固形物含量8-10％；其余为水。一种所述肽聚糖免疫增强剂的生产方法，所述的生产方法按如下步骤进行经培养菌种接种一级种子培养——二级种子罐厌氧培养；当种子液OD450＝1.2时，即每毫升种子液的细菌数量在1.1-1.4×108个时，即可接种于初始发酵罐，并在发酵过程中每间隔2小时通入适量氮气；在菌体生长至以756UV-VIS分光光度计于450nm处测量菌液OD值在1.0-1.4时终止发酵；以此发酵液为种子液接种于n个发酵罐，其每罐接种量为5-12.5％；继续培养，当以756UV-VIS分光光度计于450nm处测量发酵液OD值在1.0-1.4时终止发酵，此发酵液为目的发酵液；再经离心分离取菌体，再转至后处理罐中，加入消化缓冲液进行菌体后处理将该后处理罐中的后处理液加热加压至0.07KPa/106℃灭菌20min，再加入溶菌酶在37℃下消化24小时；当溶菌酶消化完成后，向该后处理罐内加入半胱氨酸至终浓度为5.5mmol/L，并补充EDTA至其终浓度为1.1mmol/L，之后加入木瓜蛋白酶，并在65℃下消化24小时；最终获得主要含有相对分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.5-2.0％，分子量小于20KD的蛋白质5-8％，脂肪0.3-0.5％，核糖核酸0.01-0.02％，总固形物含量为8-10％的液体肽聚糖制剂。所述的消化缓冲液，其为含有0.1mmol/L EDTA、pH6.2的磷酸盐缓冲液；该消化缓冲液的投料比是以其体积与分离收集的湿菌重量的比为2——3∶1加入到分离收集的湿菌体中的。所述的溶菌酶，其是以每升后处理液加入1-5克的投料比加入溶菌酶。所述的木瓜蛋白酶，其是以每升该处理液加入5-10克的投料比加入木瓜蛋白酶。所述的培养菌种，其是双歧杆菌选自嗜热双歧杆菌(Bifidobacteriumthermophilum)，或分叉双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，或青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolesentis)，或婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，或长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。本专利技术的优点，比照现有技术其是可以连续发酵。在第1个发酵罐发酵完成后，向罐内通入氮气将发酵液压至其它n个已注入发酵液并灭菌处理的发酵罐连续发酵，用于提高发酵产量。根据实际生产需要确定双歧杆菌的产量，通常以双歧杆菌湿菌重量为添加量参照指标。当发酵产量达到需要量时，终止发酵。将发酵液逐步注入储液罐，连续流离心机分离菌体。在本专利技术的技术中，在双歧杆菌发酵完成后，直接进行菌体后处理。首先将与发酵液分离的菌体移入发酵罐，加入消化缓冲液，菌体与消化缓冲液的比值是1∶2-3(W/V)，消化缓冲液为包含EDTA的pH6.2的磷酸盐缓冲液。本专利技术中菌体的处理分为两步进行，一是溶菌酶消化，二是蛋白酶消化，最终获得主要含有相对分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.5-2.0％，分子量小于20KD的蛋白质5-8％，脂肪0.3-0.5％，核糖核酸0.01-0.02％，总固形物含量为8-10％的液体肽聚糖制剂。就鱼虾用肽聚糖免疫增强剂的通常用途而言，液体制剂具有效果好、使用方便的优点。本专利技术与现有实验室小型发酵技术相比，本专利技术的鱼虾用肽聚糖免疫增强剂的产业化生产技术具有连续生产、产量高、生产成本低的优点。如果采用小型发酵罐实验室发酵，酸沉降和离心相结合收集菌体，多步酶消化法制备肽聚糖粗制物，每1升发酵液平均可获得4g肽聚糖制剂。使用本技术每吨发酵液的平均发酵产量为8kg，即每1升发酵液可获得8g肽聚糖制剂。这不仅是体现在单位产量和单位物质成本的差别，而且最大的差别还是体现在生产量上的差别和由于菌体细胞壁中脂磷壁酸，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰胞壁酸等其它成分，如分子量小于20KD的蛋白质5-8％，脂肪0.3-0.5％，核糖核酸0.01-0.02％，也可对对虾和贝类免疫系统产生一定的免疫调节作用和鱼类，对虾和贝类的营养成分。以生产200吨对虾肽聚糖饲料为例，200吨免疫饲料需肽聚糖制剂40公斤(以湿菌重量计)。采用本专利技术技术，从种子液培养到最终菌体处理完成需要一周的时间既可生产40公斤肽聚糖制剂。如果在实验室发酵以17升PVC发酵罐生产，以日生产量2罐计算，不间断生产需要将近一年的时间！使用本专利技术肽聚糖制剂的免疫增强剂可以弥补化学药物和疫苗的不足，它比化学药物安全性高，比疫苗应用范围广，另外本专利技术肽聚糖制剂的免疫增强剂和疫苗的混合使用也能增强疫苗的疗效。本专利技术肽聚糖制剂的免疫增强剂的功能是多方面的，在甲壳动物中，可活化血淋巴中的吞噬细胞，提高吞噬病原菌能力；本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肽聚糖免疫增强剂，其特征在于：所述的免疫增强剂具有如下的物化参数，色泽为：淡褐色的液体，粘度：３．２－５．０，比重：１．０２１－１．０４２；该免疫增强剂按Ｗ／Ｖ比含有：相对分子量小于２０ＫＤ的活性成分的肽聚糖：１．５－２．０％，分子量小于２０ＫＤ的蛋白质：５－８％，脂肪：０．３－０．５％，核糖核酸：０．０１－０．０２％，总固形物含量：８－１０％；其余为：水。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋晓玲，王秀华，黄倢，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
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