三个适于蛸属动物qPCR的内参基因及其通用引物制造技术

本发明专利技术公开了三个适于蛸属动物qPCR的内参基因以及将该基因在实时荧光定量PCR中的应用。有益效果为：该基因在不同环境和试验条件下均能稳定表达，且不受任何内外因素的影响；以elongation factor‑1 alpha、18s以及ubiquitin，elongation factor‑1 alpha为内参基因，应用于实时荧光定量PCR，能够满足实时荧光定量PCR检测蛸属动物基因转录表达水平的要求，提高了蛸属动物基因表达分析研究的稳定性和可靠性。

Three reference genes for Octopus animal qPCR and universal primers

The present invention discloses three reference genes for Octopus animal qPCR and the application of the gene in the real-time fluorescence quantitative PCR in. The beneficial effect of this gene was stably expressed in different environments and conditions, and is not affected by any external factors; elongation factor alpha, 18S 1 and ubiquitin factor 1, elongation alpha as a reference gene used in quantitative real-time PCR, which can meet the real-time fluorescent quantitative PCR detection of Octopus animal gene transcription and expression level requirements, improve the expression analysis of the stability and reliability of animal gene belongs to octopus.

【技术实现步骤摘要】
三个适于蛸属动物qPCR的内参基因及其通用引物
本专利技术属于分子生物
，尤其是涉及三个适于蛸属动物qPCR的内参基因及其通用引物。
技术介绍
合适的内参基因，是实时荧光定量PCR(qRT-PCR)中识别目的基因准确表达模式的关键因素。理想的内参基因应具备以下特征：在所有组织及细胞类型中均有表达，且不受外界条件影响；与目的基因表达水平相似。头足类是最近几年才得以广泛研究的海洋生物物种，其功能基因的研究也如火如荼，但至今头足类荧光定量PCR的内参基因多照搬贝类等其它海洋生物，仍无适于头足类自身特性的内参基因。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供三个适于蛸属动物qPCR的内参基因，该基因在不同环境和试验条件下均能稳定表达，且不受任何内外因素的影响。本专利技术的另一目的在于提供适于蛸属动物qPCR的内参基因在实时荧光定量PCR中的应用，以elongationfactor-1alpha、18s以及ubiquitin，elongationfactor-1alpha为内参基因，能够满足实时荧光定量PCR检测蛸属动物基因转录表达水平的要求，提高了蛸属动物基因表达分析研究的稳定性、可靠性和效率。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：适于蛸属动物qPCR的内参基因在实时荧光定量PCR中的应用，提取蛸属动物总RNA，反转录合成cDNA，对合成的cDNA进行实时荧光定量PCR分析检测；所用的内参基因为elongationfactor-1alpha、18s以及ubiquitin，elongationfactor-1alpha的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，18s的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，ubiquitin的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。作为优选，实时荧光定量PCR分析中，扩增elongationfactor-1alpha基因的上游引物序列为GTAGAGATGCACCACGAGTCACTT(如SEQIDNO.4所示)，下游引物序列为CATACCCACGACGAAGATCCTT(如SEQIDNO.5所示)；扩增18s基因的上游引物序列为GCGTTCGCTTCGATGAC(如SEQIDNO.6所示)，下游引物序列为GCCCTTCCGTCAATTCC(如SEQIDNO.7所示)；扩增ubiquitin基因的上游引物序列为AGAAGGTTAAGTTGGCGGTTTTG(如SEQIDNO.8所示)，下游引物序列为CCAGCTCCACATTCCTCGTT(如SEQIDNO.9所示)。上下游引物长度适当，与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低。作为优选，实时荧光定量PCR扩增体系为：取12.5μLSYBRgreenPCRmastermix、1μL模板cDNA、上下游引物(10μmol/L)各0.5μL混合，加入灭菌水至25μL；扩增条件为：将混合物在95℃预变性10min，然后95℃变性15s，60℃退火1min，72℃延伸20s，进行40个循环，最后72℃延伸1min。其中，所用SYBRgreenPCRmastermix购买于赛默飞世尔科技公司。该条件下，靶序列变性彻底，其不影响聚合酶的活性，引物延伸完全，能够达到有效的扩增量，且非特异性扩增少。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术提供了三个适于蛸属动物qPCR的内参基因，该基因在不同环境和试验条件下均能稳定表达，且不受任何内外因素的影响；本专利技术还提供了适于蛸属动物qPCR的内参基因在实时荧光定量PCR中的应用，以elongationfactor-1alpha、18s以及ubiquitin，elongationfactor-1alpha为内参基因，能够满足实时荧光定量PCR检测蛸属动物基因转录表达水平的要求，提高了蛸属动物基因表达分析研究的稳定性和可靠性。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术做进一步说明：实施例1：适于蛸属动物qPCR的内参基因在实时荧光定量PCR中的应用：1)按照Omega总RNA提取试剂盒的操作说明提取蛸属动物总RNA，再按照TaKaRa公司的PrimeScriptTMRTreagentkitwithgDNAEraser反转录试剂盒的操作说明合成cDNA；2)对步骤1)合成的cDNA进行荧光定量PCR分析检测，所用的内参基因为elongationfactor-1alpha、18s以及ubiquitin，elongationfactor-1alpha的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，18s的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，ubiquitin的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；扩增elongationfactor-1alpha基因的上游引物序列为GTAGAGATGCACCACGAGTCACTT，下游引物序列为CATACCCACGACGAAGATCCTT；扩增18s基因的上游引物序列为GCGTTCGCTTCGATGAC，下游引物序列为GCCCTTCCGTCAATTCC；扩增ubiquitin基因的上游引物序列为AGAAGGTTAAGTTGGCGGTTTTG，下游引物序列为CCAGCTCCACATTCCTCGTT；PCR扩增体系为：取12.5μLSYBRgreenPCRmastermix、1μL模板cDNA、上下游引物(10μmol/L)各0.5μL混合，加入灭菌水至25μL；扩增条件为：将混合物在95℃预变性10min，然后95℃变性15s，60℃退火1min，72℃延伸20s，进行40个循环，最后72℃延伸1min；elongationfactor-1alpha的核苷酸序列SEQIDNO.1为：CCTTGGTACGAAGGCTGGGAAATTGAGAGGAAAGAGGGTAACTGCAAGGGCAATACCCTCTTCAATGCCTTGGATTCTATTATTCCGCCGCAGAGACCAACGGAGAGACCATTGAGATTGCCCCTGCAGGATGTCTACAAGATAGGTGGTATTGGTACCGTCCCTGTTGGCAGAGTCGAGACCGGTGTCTTGAAGCCTGGTACCGTCGTGACATTTGCACCTGCCATGGTATCCACTGAGGTTAGTTGATTTTTATTGTTAACTGTATTTTTTGCTTGGAGTTGTTGCTTATAGAATTTTACTTACATTTGATTTAATTTGTATGTTTTGCTTAGGTGAAGTCTGTAGAGATGCACCACGAGTCACTTCCAGAAGCTAACCCAGGAGACAACGTTGGTTTTAACGTTAAGAACGTATCTGTAAAGGATCTTCGTCGTGGGTATGTGGCTGGTGACAGCAAGAACGACCCTCCTAAGGAAACGAAGTGCTTTGATGCCCAGGTATGTAACAAGTATTTATGAGCTCGTCTTAAGTTGAACGTGATTGTGTTTAATTTTTCTCTAAGTATATTCTATTCTCTCATGTAACTTATCATTCTCCTTACAGGTTATTGTCATTAACCACCCT；18s的核苷酸序列SEQIDNO.2为：C本文档来自技高网...

【技术保护点】
适于蛸属动物qPCR的内参基因，其特征在于：所述内参基因为elongation factor‑1 alpha、18s以及ubiquitin，elongation factor‑1 alpha的核苷酸序列SEQ ID NO.1为：CCTTGGTACGAAGGCTGGGAAATTGAGAGGAAAGAGGGTAACTGCAAGGGCAATACCCTCTTCAATGCCTTGGATTCTATTATTCCGCCGCAGAGACCAACGGAGAGACCATTGAGATTGCCCCTGCAGGATGTCTACAAGATAGGTGGTATTGGTACCGTCCCTGTTGGCAGAGTCGAGACCGGTGTCTTGAAGCCTGGTACCGTCGTGACATTTGCACCTGCCATGGTATCCACTGAGGTTAGTTGATTTTTATTGTTAACTGTATTTTTTGCTTGGAGTTGTTGCTTATAGAATTTTACTTACATTTGATTTAATTTGTATGTTTTGCTTAGGTGAAGTCTGTAGAGATGCACCACGAGTCACTTCCAGAAGCTAACCCAGGAGACAACGTTGGTTTTAACGTTAAGAACGTATCTGTAAAGGATCTTCGTCGTGGGTATGTGGCTGGTGACAGCAAGAACGACCCTCCTAAGGAAACGAAGTGCTTTGATGCCCAGGTATGTAACAAGTATTTATGAGCTCGTCTTAAGTTGAACGTGATTGTGTTTAATTTTTCTCTAAGTATATTCTATTCTCTCATGTAACTTATCATTCTCCTTACAGGTTATTGTCATTAACCACCCT； 18s的核苷酸序列SEQ ID NO.2为：CGTTTTCCTCGATCAAGAGCGAAAGTCGGAGGTTCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTTCCGACCGTAAACGATGCCGACTGGCGCTCCGCCGGCGTTCGCTTCGATGACCCGGCGGGGAGCCTGCGCGGGAAACCATAGTCGGTTCCGGGGGGAGTATGGTTGCAAAACAGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACCCAACACGGGAAAACTCACCCGGTCCGGACACCGGTAGGATTGACAGATCGATAGCTCTTTCTCGATTCGGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGCGATCCGTCTGGTTGATTCCGATAACGAACGAGACTCCGGCCTGCTAACTAGCGCGTCGATTAGTGCTTTTCCGGTAGCGT；ubiquitin的核苷酸序列SEQ ID NO.3为：TGTCAAGGCAAAGATTCAAGATAAGGAGGGAATTCCTCCAGATCAGCAAAGATTGATCTTTGCTGGTAAGCAGCTTGAGGATGGCCGTACACTGTCAGACTACAATATTCAAAAGGAATCAACCCTTCATTTGGTCCTTCGTCTGCGAGGTGGCGCCAAGAAGCGCAAGAAGAAGAATTACACCACTCCCAAAAAGAATAAGCATAAGAAGAAGAAGGTTAAGTTGGCGGTTTTGAAATATTACAAGGTTGATGAAAATGGTAAAATCACTCGTTTGCGTCGTGAGTGTCCCAACGAGGAATGTGGAGCTGGTGTGTTTATGGC。...

【技术特征摘要】
1.适于蛸属动物qPCR的内参基因，其特征在于：所述内参基因为elongationfactor-1alpha、18s以及ubiquitin，elongationfactor-1alpha的核苷酸序列SEQIDNO.1为：CCTTGGTACGAAGGCTGGGAAATTGAGAGGAAAGAGGGTAACTGCAAGGGCAATACCCTCTTCAATGCCTTGGATTCTATTATTCCGCCGCAGAGACCAACGGAGAGACCATTGAGATTGCCCCTGCAGGATGTCTACAAGATAGGTGGTATTGGTACCGTCCCTGTTGGCAGAGTCGAGACCGGTGTCTTGAAGCCTGGTACCGTCGTGACATTTGCACCTGCCATGGTATCCACTGAGGTTAGTTGATTTTTATTGTTAACTGTATTTTTTGCTTGGAGTTGTTGCTTATAGAATTTTACTTACATTTGATTTAATTTGTATGTTTTGCTTAGGTGAAGTCTGTAGAGATGCACCACGAGTCACTTCCAGAAGCTAACCCAGGAGACAACGTTGGTTTTAACGTTAAGAACGTATCTGTAAAGGATCTTCGTCGTGGGTATGTGGCTGGTGACAGCAAGAACGACCCTCCTAAGGAAACGAAGTGCTTTGATGCCCAGGTATGTAACAAGTATTTATGAGCTCGTCTTAAGTTGAACGTGATTGTGTTTAATTTTTCTCTAAGTATATTCTATTCTCTCATGTAACTTATCATTCTCCTTACAGGTTATTGTCATTAACCACCCT；18s的核苷酸序列SEQIDNO.2为：CGTTTTCCTCGATCAAGAGCGAAAGTCGGAGGTTCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTTCCGACCGTAAACGATGCCGACTGGCGCTCCGCCGGCGTTCGCTTCGATGACCCGGCGGGGAGCCTGCGCGGGAAACCATAGTCGGTTCCGGGGGGAGTATGGTTGCAAAACAGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACCCAACACGGGAAAACTCACCCGGTCCGGACACCGGTAGGATTGACAGATCGATAGCTCTTTCTCGATTCGGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGCGATCCGTCTGGTTGATTCCGATAACGAACGAGACTCCGGCCTGCTAACTAGCGCGTCGATTAGTGCTTTTCCGGTAGCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕振明，朱科桦，龚理，刘炳舰，刘立芹，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33