一种mRNA在藏绵羊低氧适应性检测中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种mRNA在藏绵羊低氧适应性检测中的应用、所述mRNA的检测方法和检测试剂盒；本发明专利技术通过系统研究藏绵羊低氧适应性mRNA表达谱，筛选经qRT‑PCR验证的与低氧适应性相关的mRNA，能够应用于藏绵羊低氧适应性检测，有助于阐明藏绵羊对低氧环境胁迫下的适应性机制，丰富极端环境下反刍动物分子生态适应性方面的基础理论，且为藏绵羊分子育种及功能基因组学研究提供科学支撑。

Application of a kind of mRNA in the detection of hypoxia adaptability in Tibetan Sheep

The application of the mRNA, the invention provides a mRNA in Tibetan sheep in the detection of hypoxia adaptability detection method and detection kit; the invention through the system research of Tibetan sheep hypoxia adaptability mRNA expression profiles, selection by qRT PCR verification and hypoxic adaptation related mRNA, can be applied to the detection of hypoxia adaptation in Tibetan Sheep that will help to clarify the Tibetan sheep to hypoxia stress adaptation mechanism, enrich the basic theory under the extreme environment of ruminant animal molecular aspects of ecological adaptability, and to provide scientific support for Tibetan sheep breeding and functional genomics research.

【技术实现步骤摘要】
一种mRNA在藏绵羊低氧适应性检测中的应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种mRNA在藏绵羊低氧适应性检测中的应用。
技术介绍
青藏高原藏绵羊主要分为高原型(草地型)、山谷型和欧拉型三大类，各地根据其自然生态特点又细分为不同的类型，属粗毛型绵羊地方品种。藏绵羊原产于青藏高原，主要分布于西藏自治区及青海、甘肃、四川、云南、贵州等地，由于各生态条件差异悬殊，形成了不同的类型。高原型(草地型)藏绵羊是主体，数量最多，主要分布于西藏境内的冈底斯山、念青唐古拉山以北的藏北高原和雅鲁藏布江地带；青海的藏绵羊主要分布在海北藏族自治州、海南藏族自治州、海西蒙古族哈萨克自治州、黄南藏族自治州、玉树藏族自治州、果洛藏族自治州六州的广阔高寒牧区；甘肃的藏绵羊主要分布在甘南藏族自治州的各县市；四川境内的藏绵羊主要分布在甘孜藏族自治州、阿坝藏族羌族自治州北部牧区。山谷型藏绵羊主要分布在青海省南部的班玛、囊谦两县的部分地区，四川省阿坝藏族羌族自治州南部牧区，云南的昭通市、曲靖市、丽江市及保山市腾冲县。欧拉型藏绵羊是一个特殊生态类型，中心产区位于甘肃省甘南藏族自治州的玛曲县欧拉乡及比邻地区及青海省河南蒙古族自治县和久治县等地。高寒和缺氧是高原地区主要的生态限制因子，高原土著动物在长期的适应进化过程中形成了独特的低氧适应性策略(Liuetal.,2016；Weietal.,2015；Beall,2013)。藏绵羊是青藏高原的土著反刍家畜和草地生态系统的重要组成部分，是藏族人民重要的生活和生产资料，同时也是其财富的象征(Longetal.,2008)。藏绵羊在粗放和传统的放牧管理模式下，千百年来对青藏高原严酷的生态环境具有极强的适应能力。藏绵羊经过长期的自然选择和进化，对高寒、低氧、强紫外线和冷季营养胁迫等恶劣的自然环境条件具有极强的适应能力，并通过生理和营养代谢加以调节(Guoetal.,2012；Wangetal.,2011)。在对高海拔藏绵羊和低海拔小尾寒羊的肺组织结构研究中，发现藏绵羊单位面积肺泡数比小尾寒羊显著增多、肺泡隔的厚度显著增加、终末细支气管的管径显著减小，并认为这些差异和特点是藏绵羊肺组织适应高原低氧的形态学特点(俞红贤，1999)。测定藏绵羊的肺动脉压、肺动脉楔压、体动脉压和心输出量、计算肺血管阻力，在NOS非选择性抑制剂的作用下，藏绵羊肺动脉压稍有增加，心输出量减少，且4500米比2300米处藏绵羊的肺血管阻力显著增大(P<0.05)；在NOS选择性抑制物作用下，只有前者的肺血管阻力增加，后者没有变化。随内源性NOS活性受到抑制，NO的生成量亦减少，促使机体肺血管收缩，使藏绵羊适应低氧环境(Ruanetal.,2004)。这与Koizumi等对不同海拔绵羊的肺血管阻力的测定结果一致(Koizumietal.,2004)。在慢性缺氧条件下，引进高海拔绵羊胎盘中的VEGF和NOS基因的表达量上调，机体通过合成VEGF来缓解低氧，这可能是低海拔绵羊在高海拔地区的长期习服机制(Parraguezetal.,2010)。在对高海拔藏绵羊和低海拔湖羊生化指标研究中，藏绵羊生化指标(红血细胞、红细胞压积、平均红细胞体积、红细胞平均血红蛋白)高或显著高，藏绵羊对低氧的适应并不是从增加血红蛋白浓度上来实现的，可能是提高了血红蛋白输送氧气的能力和效率,这些独特的生理机能有利于增加肺通气量和肺血流量，并通过内源NO产量高低来调节肺部血管系统以适应低氧的环境(Liuetal.,2016)。藏绵羊不仅形成有效摄取、输送和利用氧的结构特征和生理机制，而且通过对细胞代谢和抗低氧因子诱导从分子水平上来适应高原低氧环境(Weietal.,2016；Yangetal.,2016；Liuetal.,2016)。这主要表现在一些细胞因子、淋巴因子、激素、能量代谢、氧传输、响应缺氧、DNA修复酶等一些适应性相关基因和信号通路的变化上；处于低氧环境中的组织细胞则可能通过其膜上的氧受体分子来感受低氧信号，并启动许多低氧反应基因做出复杂的响应(Wu,2012)。近年来随基因检测技术的革新，高寒土著动物适应低氧环境的神秘面纱被逐步揭开。通过对不同海拔梯度7个地方绵羊品种122只个体进行全基因组扫描，揭示了适应低氧环境的236个差异基因和8个特异候选基因，其中EPAS1基因在高海拔低氧调控网络中起着核心作用，同时也包含了与低氧诱导因子HIF-1α相关的三个基因Adam17、Arg2、Mmp3(Weietal.,2016；Liuetal.,2016)。利用高通量测序技术及生物信息分析策略，从基因组水平充分揭示了高原藏猪(Lietal.,2013)和地山雀(Quetal.,2013)特有的低氧适应性分子机制。在饲料消化代谢方面，藏绵羊瘤胃微生物群落通过基因调控提高了饲料干物质、粗蛋白、纤维消化率、氮沉积、日粮氮利用率、有效尿素的转化利用效率(HuangandLiu,2009；周建伟，2015)，揭示了藏绵羊氮素胁迫下营养适应性机制。然而，藏绵羊是我国青藏高原特有的、古老的、品质优良的地毯毛绵羊地方群体。由于藏绵羊能够适应恶劣的高寒气候环境、充分利用其它大家畜无法利用的自然资源。因其长期生活在低氧、寒冷、干燥、辐射强烈、降水少，平均海拔4000米的高原地区，在环境压力和粗放式饲养方式下，已形成对低氧、干燥生境稳定的遗传机制。寻找自然选择和人工选择压力在藏绵羊基因组上留下的特殊痕迹，鉴定选择信号区域内重要的发生适应性突变基因以及这些基因所在的调控通路，从而在分子水平上诠释藏绵羊在漫长的进化过程中所形成的独特低氧适应性特征，揭示藏绵羊对低氧环境胁迫下的适应性机制。这是本领域技术人员多年研究的目的，但是，现有技术对低氧环境胁迫下的适应性机制并不清楚，没有任何关于mRNA在藏绵羊低氧适应性方面的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种藏绵羊肝脏组织和肺脏组织低氧适应性mRNA检测中的应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种mRNA在藏绵羊低氧适应性检测中的应用，所述mRNA为ENSOARG00000002655、ENSOARG00000005252、ENSOARG00000007592、ENSOARG00000008263、ENSOARG00000008620、ENSOARG00000009196、ENSOARG00000010493、ENSOARG00000010939、ENSOARG00000014554、ENSOARG00000014659和ENSOARG00000014870。本专利技术还提供了所述mRNA的筛选方法，包括以下步骤：1)提取具有3个生物学重复的不同海拔藏绵羊和对照组湖羊肝脏和肺脏组织样品进行mRNA测序，通过分析获得CleanData数据；2)分析所述CleanData数据获得不同海拔藏绵羊和对照组湖羊差异表达mRNA；3)筛选不同海拔藏绵羊和对照组湖羊肝脏和肺脏组织样品中显著差异表达的候选mRNA即为检测获得的低氧适应性mRNA。优选的，所述不同海拔藏绵羊包括高海拔霍巴藏绵羊和阿旺藏绵羊以及中海拔祁连白藏绵羊和甘加藏绵羊。优选的，所述步骤1)包括以下步骤：1.1)提取藏绵羊和对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种mRNA在藏绵羊低氧适应性检测中的应用，其特征在于，所述mRNA为ENSOARG00000002655、ENSOARG00000005252、ENSOARG00000007592、ENSOARG00000008263、ENSOARG00000008620、ENSOARG00000009196、ENSOARG00000010493、ENSOARG00000010939、ENSOARG00000014554、ENSOARG00000014659和ENSOARG00000014870。

【技术特征摘要】
1.一种mRNA在藏绵羊低氧适应性检测中的应用，其特征在于，所述mRNA为ENSOARG00000002655、ENSOARG00000005252、ENSOARG00000007592、ENSOARG00000008263、ENSOARG00000008620、ENSOARG00000009196、ENSOARG00000010493、ENSOARG00000010939、ENSOARG00000014554、ENSOARG00000014659和ENSOARG00000014870。2.一种藏绵羊低氧适应性相关mRNA的筛选方法，包括以下步骤：1)分别提取不同海拔藏绵羊和对照组湖羊肝脏和肺脏组织样品进行mRNA测序，通过分析获得CleanData数据；2)分析所述CleanData数据获得不同海拔藏绵羊和对照组湖羊差异表达mRNA；3)筛选不同海拔藏绵羊和对照组湖羊肝脏和肺脏组织样品中显著差异表达的候选mRNA即为检测获得的低氧适应性mRNA。3.根据权利要求2所述筛选方法，其特征在于，所述不同海拔藏绵羊包括高海拔霍巴藏绵羊和阿旺藏绵羊以及中海拔祁连白藏绵羊和甘加藏绵羊。4.根据权利要求2所述筛选方法，其特征在于，所述步骤1)包括以下步骤：1.1)提取藏绵羊和对照组湖羊肝脏和肺脏组织样品的总RNA；1.2)构建所述步骤1.1)提取总RNA的cDNA文库；1.3)质检所述步骤1.2)构建的cDNA文库；1.4)将质检合格的cDNA文库上机测序，通过分析获得CleanData数据。5.根据权利要求2或4所述筛选方法，其特征在于，所述步骤2)包括以下步骤：2.1)对所述CleanData数据进行预处理及均一化，使Q30碱基百分比大于85％，获得有效数据；2.2)将所述步骤2.1)获得的有效数据与参考基因组Oar_v3.1进行序列比对，获得MappedReads；2.3)利用Cufflinks程序将所述MappedReads进行拼接；与参考基因组注释信息进行比较分析，组装获得转录本；2.4)在所述转录本中发掘获得差异表达mRNA。6.根据权利要求5所述筛选方法，其特征在于，获...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建斌，郭宪，丁学智，曾玉峰，袁超，郭婷婷，孙晓萍，岳耀敬，梁春年，褚敏，冯瑞林，牛春娥，郭健，杨博辉，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62