一种3‑酮积雪草酸、制备方法和在干细胞领域的应用技术

本发明专利技术公开了一种3‑酮积雪草酸、制备方法和在干细胞领域的应用。本发明专利技术提供了新的积雪草酸衍生物—2‑酮积雪草酸、3‑酮积雪草酸，并提供了该2‑酮积雪草酸、3‑酮积雪草酸的制备方法，步骤包括：步骤S1，生物转化：取梅林青霉孢子悬浮液接入无菌液体培养液中培养2d；无菌条件下取适量积雪草酸加入无菌液体培养液中，继续培养3d；步骤S2，分离纯化：培养液过滤取滤液，上样于大孔树脂，用40％、75％的乙醇水溶液洗脱，收集75％乙醇洗脱液，浓缩后用反相制备液相色谱分离，根据色谱图收集2‑酮积雪草酸、3‑酮积雪草酸对应的洗脱流份。申请人研究发现，2‑酮积雪草酸、3‑酮积雪草酸可以诱导骨髓间充质干细胞成骨分化。

A 3 ketone asiatic acid, preparation method and application in the field of stem cells

The invention discloses a 3 ketone asiatic acid, preparation method and application in the field of stem cells. The present invention provides new asiatic acid derivatives - 2 ketone ketone 3 asiatic acid, asiatic acid, and provides the 2 oxalic acid, 3 ketone ketone snow asiatic acid preparation method comprises the following steps: step S1, biotransformation: Cultured 2D from Penicillium melinii spore suspension aseptic access liquid; under aseptic conditions, take proper amount of oxalic acid snow sterile liquid medium to culture 3D; step S2, separation and purification of medium after leaching filtrate, sample from macroporous resin, eluting with ethanol water solution of 40%, 75%, 75% ethanol eluates were concentrated by reversed-phase preparative liquid chromatography according to the chromatographic separation and elution fractions chromatograms collected from 2 oxalic acid, 3 ketone ketone snow snow corresponding oxalate. The study found that 2 oxalic acid, 3 ketone ketone snow asiatic acid can induce bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts.

【技术实现步骤摘要】
一种3-酮积雪草酸、制备方法和在干细胞领域的应用
本专利技术属于化学领域，涉及一种3-酮积雪草酸、制备方法和在干细胞领域的应用。
技术介绍
积雪草酸，又名亚细亚酸，是天然植物积雪草的三萜提取物的主要成分之一，具有乌苏烷型骨架结构。积雪草酸及其衍生物具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗阿尔茨海默病、保护心脑血管以及抗肿瘤等作用(参考文献：积雪草酸A环开环衍生物的合成及体外抗肿瘤活性研究，中国新药杂志2017年第26卷第10期)。微生物转化法可以实现很多化学合成无法实现的结构修饰。对积雪草酸的微生物转化是获得新型积雪草酸衍生物的重要手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸及其制备方法和在干细胞领域的应用，2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸均为积雪草酸的衍生物。实现本专利技术上述目的技术方案如下：一种2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸，其化学结构如下：一种2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的制备方法，包括如下步骤：步骤S1，生物转化：取活化后的梅林青霉斜面菌种，用无菌水冲洗斜面上的孢子，振摇，得梅林青霉孢子悬浮液；取适量孢子悬浮液接入无菌液体培养液中培养2d；无菌条件下取适量积雪草酸加入无菌液体培养液中，继续培养3d；步骤S2，分离纯化：培养液过滤取滤液，上样于AB-8型大孔吸附树脂，依次用体积百分浓度为40％、75％的乙醇水溶液洗脱，收集75％乙醇洗脱液，浓缩后用反相制备液相色谱分离，流动相为甲醇-水-三氟乙酸(60:40:3-7,V/V/V)，根据色谱图收集2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸对应的洗脱流份，浓缩干燥即得所述2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸。2-酮积雪草酸可能由梅林青霉通过如下生源途径转化得到：3-酮积雪草酸可能由梅林青霉通过如下生源途径转化得到：优选地，步骤S1于25℃、150r/min条件培养。优选地，所述液体培养液为PDB培养基。优选地，所述积雪草酸浓度为0.4-0.6mg/mL。所述的2-酮积雪草酸在诱导骨髓间充质干细胞成骨分化方面的应用。所述的3-酮积雪草酸在诱导骨髓间充质干细胞成骨分化方面的应用。本专利技术的突出优点：本专利技术提供了一种新的积雪草酸衍生物—2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸，并提供了该2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的制备方法，申请人研究发现，2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸可以诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，可以用于制备诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的试剂；本专利技术提供的制备方法步骤简单，易于大生产。附图说明图1为采用反相制备液相色谱分离75％乙醇洗脱物的色谱图；图2为骨髓间充质干细胞成骨分化的茜红素染色结果图。具体实施方式下面就结合实施例具体介绍本专利技术的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。实施例12-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸的制备一、实验材料梅林青霉PenicilliummeliniiThom购自中国科学院微生物研究所。固体培养基：PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)；转化培养基：PDB培养基(马铃薯葡萄糖液体培养基)。积雪草酸自制，纯度大于98％。二、实验方法和结果2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的制备方法，包括如下步骤：步骤S1，生物转化：取活化后的梅林青霉斜面菌种，用无菌水冲洗斜面上的孢子，振摇，得梅林青霉孢子悬浮液；取适量孢子悬浮液接入无菌液体培养液中于25℃、150r/min条件培养2d；无菌条件下取适量积雪草酸加入无菌液体培养液中，积雪草酸浓度为0.5mg/mL，于25℃、150r/min条件继续培养3d；步骤S2，分离纯化：培养液过滤取滤液，上样于AB-8型大孔吸附树脂，依次用体积百分浓度为40％、75％的乙醇水溶液洗脱，收集75％乙醇洗脱液，浓缩后用反相制备液相色谱分离，色谱柱UltimateXB-C8(10μm,10mm×250mm)，流速2.5mL/min，柱温25℃，检测波长为210nm，进样量0.5mL，流动相为甲醇-水-三氟乙酸(60:40:5,V/V/V)，根据色谱图(如图1A所示；图1B为对比色谱图，流动相中不添加三氟乙酸)收集2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸对应的洗脱流份，浓缩干燥即得所述2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸，纯度均大于98％。结构鉴定：2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸与积雪草酸碳谱结构鉴定数据对比如下。根据高分辨质谱可知，2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的分子式为C30H46O4，比积雪草酸少一个H2O。根据碳谱的酮羰基以及氢谱(600MHz,CDCl3)羟基数量可知，2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸为积雪草酸脱水后发生烯醇变化的产物。再根据2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸氢谱中C23羟基氢的化学位移确定2-酮积雪草酸(δ4.24，相对3-酮积雪草酸位于高场)、3-酮积雪草酸(δ6.34，相对2-酮积雪草酸位于低场)的酮羰基位置。实施例22-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸的制备一、实验材料梅林青霉PenicilliummeliniiThom购自中国科学院微生物研究所。固体培养基：PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)；转化培养基：PDB培养基(马铃薯葡萄糖液体培养基)。积雪草酸自制，纯度大于98％。二、实验方法和结果2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的制备方法，包括如下步骤：步骤S1，生物转化：取活化后的梅林青霉斜面菌种，用无菌水冲洗斜面上的孢子，振摇，得梅林青霉孢子悬浮液；取适量孢子悬浮液接入无菌液体培养液中于25℃、150r/min条件培养2d；无菌条件下取适量积雪草酸加入无菌液体培养液中，积雪草酸浓度为0.4mg/mL，于25℃、150r/min条件继续培养3d；步骤S2，分离纯化：培养液过滤取滤液，上样于AB-8型大孔吸附树脂，依次用体积百分浓度为40％、75％的乙醇水溶液洗脱，收集75％乙醇洗脱液，浓缩后用反相制备液相色谱分离，流动相为甲醇-水-三氟乙酸(60:40:3,V/V/V)，根据色谱图(与图1A基本一致，仅色谱峰分离度不同，均大于1.5，符合规定)收集2-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸对应的洗脱流份，浓缩干燥即得所述2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸，纯度均大于98％。实施例32-酮积雪草酸和3-酮积雪草酸的制备一、实验材料梅林青霉PenicilliummeliniiThom购自中国科学院微生物研究所。固体培养基：PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)；转化培养基：PDB培养基(马铃薯葡萄糖液体培养基)。积雪草酸自制，纯度大于98％。二、实验方法和结果2-酮积雪草酸、3-酮积雪草酸的制备方法，包括如下步骤：步骤S1，生物转化：取活化后的梅林青霉斜面菌种，用无菌水冲洗斜面上的孢子，振摇，得梅林青霉孢子悬浮液；取适量孢子悬浮液接入无菌液体培养液中于25℃、150r/min条件培养2d；无菌条件下取适量积雪草酸加入无菌液体培养液中，积雪草酸浓度为0.6mg/mL，于25℃、150r/min条件继续培养3d；步骤S2，分离纯化：培养液过滤取滤液，上样于AB-8型大孔吸附树脂，依次用体积百分浓度为40％、75％的乙醇水溶液洗脱，收集75％乙醇洗脱液，浓缩后用反相制备液相色谱分离，流动相为甲醇-水-三氟乙酸(60:40:7,V/V/V)，根据色谱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种3‑酮积雪草酸，其化学结构如下：

【技术特征摘要】
1.一种3-酮积雪草酸，其化学结构如下：2.权利要求1所述3-酮积雪草酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1，生物转化：取活化后的梅林青霉斜面菌种，用无菌水冲洗斜面上的孢子，振摇，得梅林青霉孢子悬浮液；取适量孢子悬浮液接入无菌液体培养液中培养2d；无菌条件下取适量积雪草酸加入无菌液体培养液中，继续培养3d；步骤S2，分离纯化：培养液过滤取滤液，上样于AB-8型大孔吸附树脂，依次用体积百分浓度为40％、75％的乙醇水溶液洗脱，收集75％乙醇洗脱液，浓缩后用反相制备液相...

【专利技术属性】
技术研发人员：王莉，孙天娇，王旻，
申请(专利权)人：南京盖斯夫医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32