一种从冻存脐血中分离内皮祖细胞的方法技术

本发明专利技术公开一种从冻存脐血中分离内皮祖细胞的方法，发现直接通过获得冻存脐血的总有核细胞数，并将其铺于人纤维黏连蛋白包被的培养皿中培养，即可获得内皮祖细胞；获得内皮祖细胞的方法高效、简便，无外源性培养物质便于细胞调整并可用于临床；可得到大量纯化的内皮祖细胞；使用本发明专利技术方法85%以上冻存脐血可以分离获得内皮祖细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种从冻存脐血中分离内皮祖细胞的方法
本专利技术涉及内皮祖细胞的分离
，尤其涉及一种从冻存脐血中分离内皮祖细胞的方法。
技术介绍
心血管疾病(cardiovasculardisease，CVDs)，包括动脉粥样硬化、中风、心肌梗塞，在世界范围内是导致死亡的主要原因。血管内皮急性损伤是心血管疾病的病理基础，血管内皮的再生对血管修复起着至关重要的作用。内皮重建需要周围成熟的内皮细胞的迁移与增殖。然而，成熟的内皮细胞是一类终极分化细胞，其扩增能力低且受损内皮组织的修复能力有限。近年来，原位移植干细胞和祖细胞对损伤的组织起到了良好的治疗效果，凸显了干细胞疗法对缺血性心血管病的强大潜力。内皮祖细胞EPCs（Endothelialprogenitorcells，EPCs）来源于骨髓，存在于骨髓、外周血、脐血，新研究表明在脂肪组织、心肌中也能发现EPCs的存在。EPCs是能够增殖、迁移、粘附并分化为血管内皮细胞潜能的一种原始细胞，参与出生后缺血组织的血管发生和血管损伤后的修复。流式细胞检测发现成人外周血中单个核细胞表达的CD34+细胞仅为脐血单个核细胞中CD34+细胞的1/10，因此脐血是体外分离获得EPCs细胞的最佳来源。较成人外周血来源的EPCs，脐血来源的EPCs细胞具有更强的分化能力与增殖能力。体内研究发现，外周血内皮祖细胞形成的新生血管稳定性差，3周后出现退化现象，然而脐血来源内皮祖细胞能够产生正常具有功能的新生血管，并能够持续存在至少4月。因此临床治疗中使用脐血来源的EPCs可能会获得更意想不到的治疗效果，移植后血管形成速率可能会更高。世界范围内多个国家与地区均建立脐血库，截止日前共储存了几十万份冻存的脐血，旨在将来能够用于临床治疗。脐血被作为非恶性疾病、获得性或者遗传性骨髓衰竭综合征的治疗手段。目前公共脐血库利用率不足10%，为拓展脐血的临床应用，越来越多的学者开始关注脐血中内皮祖细胞在血管相关性疾病中的应用前景。日前，内皮祖细胞临床应用治疗心脑血管病的仅限制于自体内皮祖细胞移植，即骨髓来源的内皮祖细胞。脐血来源的内皮祖细胞输注至具有正常骨髓功能的病人体内，为避免诱发严重的移植物抗宿主反应（graft-versus-hostdiseases，GVHDs)，需要进行HLA配型，而脐血库中冻存的脐血均具有详细的HLA分型信息，因此探索从异体冻存脐血中成功分离培养内皮祖细胞能够充分利用公共库脐血资源，具有巨大的市场需求及重要的临床意义。94%新鲜脐血中能够成功分离到内皮祖细胞，然而仅有约55%冻存脐血中能够分离到内皮祖细胞。
技术实现思路
为提高从冻存的脐血中分离EPCs的效率与纯度，以及体外扩增获得高纯度具有肢体缺血损伤修复功能性的EPCs，本专利技术提供了一种从冻存脐血中分离内皮祖细胞的方法。该方法高效、简便，可以利用脐血库丰富的冻存脐血资源，可得到大量纯化的内皮祖细胞。本专利技术所提供的一种从冻存脐血中分离内皮祖细胞的方法，包括以下步骤：（1）自液氮罐中迅速取出30~50ml冻存脐血，37℃复苏，将融化后的脐带血，转入离心管中，添加100ml含0.5%人血清白蛋白的PBS缓冲液，充分混匀，室温下1500rpm/min离心10min，升速9，降速7，弃上清，获得总有核细胞（TNCs）沉淀；（2）将步骤（1）中TNCs沉淀用100ml含0.5%人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬后，室温下1000rpm/min离心5min，升速9，降速9，弃上清，重复两次，获得总有核细胞TNCs沉淀。（3）将步骤（2）中的总有核细胞TNCs沉淀，用15mlEGM-2&SingleQuots培养液重悬，获得总有核细胞悬液，接种至预先包被人纤维黏连蛋白的培养皿中，用内皮祖培养液培养，获得内皮祖细胞；优选地，所述步骤（2）中内皮细胞培养液为为LonzaEGM-2培养液添加10%FBS，即EGM-2&SingleQuots培养液。优选地，所述步骤（3）中内皮祖细胞培养液诱导培养方法：用内皮祖培养液培养，置于37℃、5%CO2及饱和湿度的条件下，3天更换培养液一次，贴壁筛选培养2-3周，获得鹅卵石状内皮祖集落，细胞消解传代，扩增培养。优选地，所述步骤（3）中内皮祖细胞培养至第4代次，可获得2×108以上内皮祖细胞。本专利技术的优点：1、可以利用脐血库丰富的冻存脐血资源；2、获得EPCs方法高效、简便，无外源性物质便于细胞调整并可用于临床；3、可得到大量纯化的内皮祖细胞；4、提高冻存脐血内皮祖细胞的分离效率，使用本专利技术方法85%以上冻存脐血可以分离获得EPCs；5、本专利技术所提供的冻存脐血中内皮祖细胞的分离培养方法中所使用的试剂及仪器均可由市场购得。附图说明：图1：分离获得的内皮祖细胞集落。A为培养2-3周后出现的内皮祖细胞集落；B为培养3-5周后内皮祖细胞集落生长状态；C为第一代内皮祖细胞生长状态。图2：分离培养的第一代内皮祖细胞流式分析细胞表型。图3：免疫荧光法测定内皮祖细胞标志性Marker的表达情况：CD34、CD133、VEGFR、v-WF检测均为阳性。图4：分离获得的内皮祖细胞形成基质胶毛细管，该细胞能够形成毛细管样结构。图5：分离获得的内皮祖细胞体外吸收低密度脂蛋白功能鉴定：如图所示，红色为标记的Dil-Ac-LDL，蓝色标记为细胞核，因此可以得出内皮祖细胞对低密度脂蛋白有较好的吸收作用。具体实施方式：本专利技术公开一种从冻存脐血中分离内皮祖细胞的方法，直接通过获得冻存脐血的总有核细胞数，并将其铺于人纤维黏连蛋白包被的培养皿中培养，即可获得内皮祖细胞，方法简单有效。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1冻存脐血EPCs的分离与培养冻存脐血取自山东省脐血造血干细胞库，经检测合格的正式入库的脐血。（1）自液氮罐中迅速取出一份（30-50ml）冻存脐血，置于37℃水浴锅中，边孵育边摇晃冻存袋，快速复苏，将融化后的脐血，转入250ml离心管中，并添加100ml含0.5%人血清白蛋白的预冷的PBS缓冲液，充分混匀，室温下1500rpm/min离心10min，升速9，降速7，弃上清，获得总有核细胞（TNCs）沉淀；（2）将步骤（1）中TNCs沉淀用100ml含0.5%人血清白蛋白的预冷的PBS缓冲液重悬后，室温下1000rpm/min离心5min，升速9，降速9，弃上清，重复两次，获得总有核细胞TNCs沉淀，然后使用15mlEGM-2&SingleQuots培养液重悬，获得总有核细胞悬液，计数，一份冻存脐血可获得共2-6×108TNCs；（3）将步骤（2）中的TNCs接种至预先包被人纤维黏连蛋白的培养皿中，用EGM-2&SingleQuots培养液培养，该培养液中包含多种因子如rhEGF、rhFGF-B、VEGF、Herparin、R3-IGF-1等，置于37℃、5%CO2及饱和湿度的条件下培养；（4）培养3d后，将未贴壁细胞吸弃，添加新鲜EGM-2&SingleQuots培养液培养，以后3天更换培养液一次；（5）培养3周后，出现1~4个鹅卵石铺路石样内皮祖细胞集落（图1A），继续培养2周后，内皮祖细胞集落中心细胞，细胞间紧密接触，细胞沿边缘向外快速增殖（图1B），使用0.25%胰酶传代培养至T75本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从冻存脐血中分离内皮祖细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）自液氮罐中迅速取出30~50ml冻存脐血，37℃复苏，将融化后的脐带血，转入离心管中，添加100ml含0.5%人血清白蛋白的PBS缓冲液，充分混匀，室温下1500rpm/min离心10min，升速9，降速7，弃上清，获得总有核细胞沉淀；（2）将步骤（1）中沉淀用100ml含0.5%人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬后，室温下1000rpm/min离心5min，升速9，降速9，弃上清，重复两次，获得总有核细胞沉淀；（3）将步骤（2）中的总有核细胞沉淀，用15ml EGM‑2& Single Quots培养液重悬，获得总有核细胞悬液，接种至预先包被人纤维黏连蛋白的培养皿中，用内皮祖培养液培养，获得内皮祖细胞。

【技术特征摘要】
1.一种从冻存脐血中分离内皮祖细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）自液氮罐中迅速取出30~50ml冻存脐血，37℃复苏，将融化后的脐带血，转入离心管中，添加100ml含0.5%人血清白蛋白的PBS缓冲液，充分混匀，室温下1500rpm/min离心10min，升速9，降速7，弃上清，获得总有核细胞沉淀；（2）将步骤（1）中沉淀用100ml含0.5%人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬后，室温下1000rpm/min离心5min，升速9，降速9，弃上清，重复两次，获得总有核细胞沉淀；（3）将步骤（2）中的总有核细胞沉淀，用15mlEGM-2&SingleQuots培养液重悬，获得总有核细胞悬液，接种至预先包被人纤维黏连蛋白的培养皿中，用...

【专利技术属性】
技术研发人员：付亚茹，孙阳阳，曲廷瑜，
申请(专利权)人：山东省齐鲁干细胞工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37