人胚胎干细胞的分化制造技术

本发明专利技术提供促进多能干细胞分化的方法和与该方法相关或由该方法产生的产物。具体地讲，本发明专利技术提供形成胰腺激素表达细胞和胰腺激素分泌细胞的改进方法。此外，本发明专利技术还提供在不使用饲养细胞层的情况下促进多能干细胞分化的方法和与该方法相关或由该方法产生的产物。本发明专利技术还提供在衍生自多能干细胞的胰岛素产生细胞中促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌的方法。

【技术实现步骤摘要】
人胚胎干细胞的分化本申请是申请日为2008年11月25日，申请号为200880117963.2(PCT/US2008/084705)，专利技术名称为“人胚胎干细胞的分化”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术提供促进多能干细胞分化的方法和与该方法相关或由该方法产生的产物。具体地讲，本专利技术提供形成胰腺激素表达细胞和胰腺激素分泌细胞的改进方法。此外，本专利技术还提供在不使用饲养细胞层的情况下促进多能干细胞分化的方法和与该方法相关或由该方法产生的产物。本专利技术还提供在衍生自多能干细胞的胰岛素产生细胞中促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌的方法。
技术介绍
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞，例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的一组细胞。诸如例如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标志物，例如HNF-3β、GATA4、Mixl1、CXCR4和Sox-17。多能干细胞可表达阶段特征性胚胎抗原(SSEA)3和4以及可用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标志物中的一种或多种(Thomson等人，Science282:1145,1998)。多能干细胞体外分化导致丧失SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达(如果存在的话)，并增加SSEA-1的表达。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用VectorRed作为底物显影来检测，如生产商所描述的(VectorLaboratories,BurlingameCalif)。未分化的多能干细胞还通常表达Oct-4和TERT，这可通过RT-PCR检测。通常在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可以多种方式支持多能干细胞。或者，在培养系统中培养多能干细胞，所述培养系统基本上不含饲养细胞，但同样支持多能干细胞的增殖而不会进行显著的分化。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，用化学成分确定的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。例如，Reubinoff等人(NatureBiotechnology18:399-404(2000))和Thompson等人(Science，1998年11月6日：第282卷，第5391期，第1145–1147页)公开了用小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层来培养来自人胚泡的多能干细胞系。Richards等人(StemCells21:546-556,2003)对一组11种不同的成人、胎儿和新生儿饲养细胞层支持人多能干细胞培养的能力进行了评价。Richards等人声称：“在成人皮肤成纤维细胞饲养层上培养的人胚胎干细胞系保持了人胚胎干细胞形态并保持了多能性”。US20020072117公开了可产生支持灵长类多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基的细胞系。所采用的细胞系是从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的间质细胞系和成纤维细胞样细胞系。US20020072117还公开了所述细胞系作为原代饲养细胞层的用途。又如，Wang等人(StemCells23:1221-1227,2005)公开了用于人多能干细胞在衍生自人胚胎干细胞的饲养细胞层上长期生长的方法。又如，Stojkovic等人(StemCells200523:306-314,2005)公开了一种衍生自人胚胎干细胞的自发分化的饲养细胞系统。在另一例子中，Miyamoto等人(StemCells22:433-440,2004)公开了从人胎盘获得的饲养细胞的来源。Amit等人(Biol.Reprod68:2150-2156,2003)公开了衍生自人包皮的饲养细胞层。又如，Inzunza等人(StemCells23:544-549,2005)公开了来自人出生后包皮成纤维细胞的饲养细胞层。US6642048公开了可支持灵长类多能干(pPS)细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基以及可用于产生这种培养基的细胞系。US6642048声称：“本专利技术包括从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的间质细胞系和成纤维细胞样细胞系。在本公开中描述并阐明了用于衍生这种细胞系、处理培养基以及用该调理培养基培育干细胞的方法”。又如，WO2005014799公开了一种用于哺乳动物细胞的维持、增殖和分化的调理培养基。WO2005014799声称：“通过鼠细胞(特别是分化并永生化的转基因肝细胞，称为MMH(Met鼠肝细胞))的细胞分泌活性对根据本专利技术制备的培养基进行调理”。又如，Xu等人(StemCells22:972-980,2004)公开了一种从人胚胎干细胞衍生物获得的调理培养基，所述干细胞衍生物已经过遗传修饰而过表达人端粒酶逆转录酶。又如，US20070010011公开了一种用于维持多能干细胞的化学成分确定的培养基。一种可供选择的培养系统采用补充有能促进胚胎干细胞增殖的生长因子的无血清培养基。例如，Cheon等人(BioReprodDOI:10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了一种无饲养细胞的无血清培养系统，其中胚胎干细胞维持在补充有能引发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子的未经调理的血清替代(SR)培养基中。又如，Levenstein等人(StemCells24:568-574,2006)公开了使用补充有bFGF的培养基，在不存在成纤维细胞或调理培养基的情况下长期培养人胚胎干细胞的方法。又如，US20050148070公开了一种在无血清且无成纤维细胞饲养细胞的成分确定的培养基中培养人胚胎干细胞的方法，该方法包括：在含有白蛋白、氨基酸、维生素、矿物质、至少一种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、至少一种胰岛素或胰岛素替代品的培养基中培养干细胞，该培养基基本上无哺乳动物胎儿血清且含有至少约100ng/ml能激活成纤维细胞生长因子信号转导受体的成纤维细胞生长因子，其中该生长因子的供给来源不是仅为成纤细胞饲养层，该培养基支持干细胞在无饲养细胞或调理培养基的情况下以未分化状态增殖。又如，US20050233446公开了一种可用于培养干细胞的化学成分确定的培养基，所述干细胞包括未分化的灵长类原始干细胞。在溶液中，该培养基与被培养的干细胞基本上等渗。在给定的培养物中，特定的培养基包含基础培养基和各为一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸，所述bFGF、胰岛素和抗坏血酸为支持原始干细胞进行基本上非分化性生长所必需。又如，US6800480声称“在一个实施例中，提供了用于培养处于基本上未分化状态的衍生自灵长类的原始干细胞的细胞培养基，其包括可有效支持衍生自灵长类的原始干细胞生长的低渗透压、低内毒素的基础培养基。该基础培养基与可有效支持衍生自灵长类的原始干细胞生长的营养血清和选自饲养细胞和衍生自饲养细胞的胞外基质组分的基质物质相混合。该培养基还包括非必需氨基酸、抗氧化剂和选自本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生胰腺内胚层细胞的方法，包括如下步骤：通过用至少一种因子处理定形内胚层细胞使所述定形内胚层细胞分化成胰腺内胚层细胞，所述至少一种因子选自：视黄酸、FGF‑2、FGF‑4、FGF‑7、FGF‑10、音猬蛋白抑制剂、能抑制BMP的因子和导蛋白。

【技术特征摘要】
2007.11.27 US 60/9905291.一种产生胰腺内胚层细胞的方法，包括如下步骤：通过用至少一种因子处理定形内胚层细胞使所述定形内胚层细胞分化成胰腺内胚层细胞，所述至少一种因子选自：视黄酸、FGF-2、FGF-4、FGF-7、FGF-10、音猬蛋白抑制剂、能抑制BMP的因子和导蛋白。2.一种产生胰腺内胚层细胞的方法，包括如下步骤：a.使多能干细胞分化成定形内胚层细胞，和b.通过用至少一种因子处理定形内胚层细胞使所述定形内胚层细胞分化成胰腺内胚层细胞，所述至少一种因子选自：视黄酸、FGF-2、FGF-4、FGF-7、FGF-10、音猬蛋白抑制剂、能抑制BMP的因子和导蛋白。3.权利要求2的方法，还包括培养多能干细胞。4.权利要求1的方法，其中所述定形内胚层细胞来源于多能干细胞。5.权利要求1或4的方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞。6.权利要求5的方法，其中所述人多能干细胞是来源于确立的人胚胎干细胞系的细胞或确立的人胚胎干细胞系。7.权利要求1或2的方法，其中所述定形内胚层细胞至少用导蛋白处理。8.权利要求1或2的方法，其中将所述定形内胚层细胞用至少一种选自如下的因子处理1至6天：视黄酸、FGF-2、FGF-4、FGF-7、FGF-10、音猬蛋白抑制剂、能抑制BMP的因子和导蛋白。9.权利要求1或2的方法，其中将所述定形内胚层细胞用音猬蛋白抑制剂和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理1至3天，然后用音猬蛋白抑制剂、视黄酸和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理所述细胞1至4天。10.权利要求9的方法，其中将所述定形内胚层细胞用音猬蛋白抑制剂、视黄酸和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理4天。11.权利要求1或2的方法，其中将所述定形内胚层细胞用音猬蛋白抑制剂和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理1至3天，然后用音猬蛋白抑制剂、能抑制BMP的因子、视黄酸和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理所述细胞1至4天。12.权利要求11的方法，其中将所述定形内胚层细胞用音猬蛋白抑制剂和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理3天。13.权利要求1或2的方法，其中将所述定形内胚层细胞用音猬蛋白抑制剂、能抑制BMP的因子、视黄酸和和至少一种选自FGF-2、FGF-4...

【专利技术属性】
技术研发人员：A雷扎尼亚，
申请(专利权)人：生命扫描有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US