二倍体红鲫尾鳍细胞系2nFC及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种二倍体红鲫尾鳍细胞系2nFC，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201731，其细胞形态为典型的成纤维状细胞，染色体众数为2n＝96，染色体数目正确，可以进行冷冻保存及细胞复苏；该细胞系可以连续传代，目前已传代120代以上，且细胞增殖稳定，能提供大量的细胞用于鱼类免疫学及病毒学研究；同时该细胞系可以进行转染和用于基因功能研究，这为进行该鱼的免疫学及病毒学研究奠定了基础，还为二倍体鱼功能基因体外研究奠定了坚实的平台。本发明专利技术还提供了二倍体红鲫尾鳍细胞系2nFC的构建方法，以改良二倍体红鲫尾鳍组织为材料，将尾鳍组织剪碎后采用组织块贴壁法启动原代培养所获得。

The construction method and application of the caudal fin cell line 2nFC of diploid red crucian carp

The invention discloses a diploid red crucian carp caudal fin cell line 2nFC, which is preserved in the China type culture collection center, the preservation number is CCTCC NO:C201731, the cell morphology of fibrous cells typical of the chromosome number of 2n = 96, the chromosome number is correct, can carry on cryopreservation and recovery of the cells; the cells can continuous passage, currently has more than 120 passages, cell proliferation and stability, can provide a large number of cells used in immunology and virology and fish; the cell line can be used for transfection and gene function research, which laid the foundation for the study of immunology and virology of the fish, but also laid a solid platform for research the function of genes in diploid fish. The invention also provides a method for constructing the 2nFC of the diploid red crucian carp cell line. In order to improve the tissue of caudal fin of the diploid red crucian carp, the caudal fin tissue is shredded and the primary culture is initiated by tissue block adherence.

【技术实现步骤摘要】
二倍体红鲫尾鳍细胞系2nFC及其构建方法和应用
本专利技术属于鱼类细胞生物学领域，尤其涉及一种二倍体红鲫尾鳍细胞系2nFC及其构建方法和应用。
技术介绍
湖南师范大学生命科学学院鱼类发育生物学研究室以红鲫(Carassiusaμratasred.Var,2n＝100)为母本、湘江野鲤(Cyprinuscarpio,2n＝100)为父本进行杂交，子一代(F1)中发现部分可育后代。通过F1自交获得二倍体后代F2；F2代可以产生不减数配子，其自交得到了四倍体F3。F3为雌雄均可育、染色体数目为200的异源四倍体。该异源四倍体鲫鲤群体雌雄可育且能稳定的产生二倍体配子，使得四倍体特征能够连续稳定遗传，目前已繁殖到F25代。改良二倍体红鲫和改良四倍体鲫鲤的成功研制都依赖于能稳定产生二倍体卵子的雌核发育二倍体鲫鲤克隆体系。雌核发育二倍体鲫鲤的研制的流程如下：分别采取雌性和雄性异源四倍体鲫鲤(AT)所产生的二倍体卵子和二倍体精子，对这两种配子进行雌核发育和雄核发育研究。雌性异源四倍体鲫鲤产生的卵子不经过染色体加倍处理，可直接被灭活的散鳞镜鲤精子激活并发育为完全由雌性个体组成的第一代(G1,2n＝10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种二倍体红鲫尾鳍细胞系2nFC，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201731。

【技术特征摘要】
1.一种二倍体红鲫尾鳍细胞系2nFC，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201731。2.一种如权利要求1所述的二倍体红鲫尾鳍细胞系2nFC的构建方法，主要包括以下步骤：(1)从二倍体红鲫尾鳍进行取材，消毒漂洗后剪成尾鳍组织小块；(2)将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块用胎牛血清浸泡后，在DMEM培养基中进行原代培养；(3)待步骤(2)后得到的细胞生长至形成单层后，加入胰酶进行消化，终止消化后进行传代培养。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括以下步骤：(1)用体积浓度为70％～75％的酒精对要取材的二倍体红鲫尾鳍进行消毒后，剪取尾鳍组织，用体积浓度为70％～75％的酒精浸泡，再用磷酸缓冲液漂洗后剪成0.5～1mm2的尾鳍组织小块；(2)将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块用磷酸缓冲液清洗，进行离心，去上清，再用磷酸缓冲液重复清洗，加入尾鳍组织小块5～10倍体积的胎牛血清浸泡0.5～1h，进行离心，去上清后，将得到的尾鳍组织小块均匀接种于培养皿底部，25℃下倒置干贴1～2h后，往培养皿中加入DMEM培养基，置于25℃且含体积5％CO2的培养箱中培养；(3)当细胞生长至形成单层后，去除培养皿中的培养基并加入磷酸缓冲液润洗细胞，去除磷酸缓冲液，加入质量浓度0.25％的胰酶进行消化，除去胰酶，加入DMEM培养基终止消化，用移液器轻轻吸打使细胞充分分离，以1：2～3的细胞数量比进行传代，然后仍置于培养箱中继续培养，待其再次长至单层后，依照上述方法再进行传代培养，将得到的二倍体红鲫尾鳍细胞系2nFC进行细胞冻存和细胞复苏。4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，所述二倍体红鲫为改良二倍体红鲫。5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中的DMEM培养基，其中还包括青霉素、链霉素、人碱性成纤维细胞生长因子和胎牛血清，使青霉素的浓度为100Iμ/mL，链霉素的浓度为100μg/mL，碱性成纤维细胞生长...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯浩，刘少军，傅永明，肖军，肖俊，周维，彭灵芝，吴慧，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43