超声固相破碎细胞的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种超声固相破碎细胞的方法及应用。本发明专利技术是将细胞样品经前处理后，精确设置超声功率和超声处理时间，将经预处理的细胞样品进行超声破碎。本发明专利技术首次提供采用超声固相破碎法破碎细胞的技术方案，针对细胞的特点，设置精确的超声条件，尤其是精确确定超声功率和超声处理的时间，克服了细胞破碎过程中成本高、易引起温度的剧烈上升、产物容易失活的缺陷，细胞破碎的效果非常显著。本发明专利技术方法针对细胞破碎难题，很好地解决了各类菌种、组织、生物样本的细胞破碎问题，尤其是针对组织细胞和细菌细胞经破碎提取蛋白质或者DNA方面。

Method and application of ultrasonic solid phase breaking cells

【技术实现步骤摘要】
超声固相破碎细胞的方法及应用
本专利技术涉及超声固相破碎
，更具体地，涉及一种超声固相破碎细胞的方法及应用。
技术介绍
破碎细胞，提取其中的各种物质，分析细胞的结构和遗传物质对人类的发展具有重要的意义。细胞破碎的难易决定于其类型。现有的细胞破碎包括化学破碎方法、机械破碎方法和物理破碎方法。化学破碎方法有渗透冲击法、表面活性剂増溶法或有机溶剂溶解法，这些化学法较温和，但细胞破坏后产物也不会产生不可逆的变性，规模容易放大。例如血红细胞的破坏一般采用渗透冲击法，通过渗透压破坏细胞，效果比较温和，成本较低；大肠杆菌一般采用増溶法，通过表面活性剂胆盐作用于大肠杆菌，效果比较温和，成本适中；酵母细胞一般采用有机溶剂溶解法，用有机溶剂甲苯溶解细胞壁并使之失稳，效果比较适中，成本较低。这些方法各有优缺点，例如酶消化法虽然条件温和，具有选择性，但是价格昂贵。有的方法破坏了细胞壁但是也破坏了产物。机械法包括匀浆法(孔型或片型)、研磨法、超声波法、珠磨破碎法，通过高的剪切力破坏细胞。动物组织及动物细胞一般采用片型匀浆法，通过细胞被搅拌器劈碎，效果和成本均适中；细胞悬浮液的大规模处理现有一般采用孔型匀浆法，须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎；植物细胞的大规模处理一般采用珠磨破碎法，通过细胞被玻璃珠或铁珠捣碎。现有的超声波应用于细胞悬浮液的小规模处理，用超声波的空穴作用使细胞破碎。热量的产生是机械法无法克服的缺陷。物理破碎法主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。主要包括反复冻溶法、急热骤冷法、超声波处理等。其中超声波处理是用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂。超声波是物质介质中的一种弹性机械波，它既是一种波动形式，又是一种能量形式。超声对细胞的作用主要有热效应、空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时，摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动，使部分能量转化为局部高热。空化效应是在超声照射下，生物体内形成空泡，随着空泡震动和其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡。另外，空化泡破裂时产生瞬时高温高压，可使水蒸气热解离产生.OH自由基和.H原子，由.OH自由基和.H原子引起的氧化还原反应可导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。机械效应是超声的原发效应，超声波在传播过程中介质质点交替地压缩与伸张构成了压力变化，引起细胞结构损伤。损伤作用的强弱与超声的频率和强度密切相关。超声处理中，声能传递，散热均有困难，需要采取针对性的降温措施。空化作用是细胞破坏的直接原因，同时会产生活性氧和化学自由基团易使产物失活，所以其影响了其在大规模的工业上的应用。由于种种局限，超声波破碎法目前未能应用于对超声波敏感的细胞以及核酸。本申请人在申请号为2014105033514的中国专利申请中公开了一种超声波微生物分散方法及装置。将超声波经过超声波换能器后直接作用于盛放待分散微生物的容器的外壁，使超声波直接通过器壁传递到待分散样品中，不需要通过液体介质，然后利用超声空化作用，达到将微生物团进行分散和解团聚的效果，从而达到分散的目的。这样分散过程中既可以密封分散，同时也避免了器壁表面挂附液体，影响后续操作。但该方法在应用的过程中同样存在局限性，只限于应用于比较顽固的难分散的菌种处理，如应用于结核菌等把细菌打散。目前未见超声破碎方法成功应用于菌种破碎方面的研究突破，即应用于破碎样本细胞壁的研究，更加未见将所述方法应用于组织细胞破碎方面。而成功破碎样本细胞壁后才能方便后续进一步提取蛋白质、DNA等如果能采用简单易行的超声固相破碎细胞的方法破碎菌种或组织细胞，将为检测试验等科学研究活动带来突破性革命并奠定根本性技术基础。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有细胞的破碎技术不足，提供一种超声固相破碎细胞的方法。本专利技术另一要解决的技术问题是提供所述超声固相破碎细胞方法的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：提供一种超声固相破碎细胞的方法，包括以下步骤：S1.细胞样品经预处理，得到预处理样品；S2.将超声波经过超声波换能器后直接作用于盛放经步骤S1预处理的细胞样品的容器外壁，设置超声功率和超声时间，将经步骤S1预处理的细胞样品进行超声处理，超声处理后离心取上清；其中，步骤S2所述超声处理的超声功率为40W～180W；超声时间为10～40min。优选地，步骤S2所述超声处理的超声功率为80W～180W。优选地，步骤S2所述超声处理的超声功率为160W～180W。优选地，步骤S2所述超声处理的超声功率为180W。本专利技术同时提供了所述超声固相破碎细胞的方法的应用，可以很好地应用于破碎组织细胞或细菌细胞方面，尤其是经细胞破碎提取细胞蛋白质或者DNA方面。本专利技术步骤S2超声后离心取上清，分别测OD260和蛋白浓度，统计分析数据。所述方法在组织细胞为海拉细胞、红细胞或动物肝细胞；所述细菌为黑曲霉、大肠杆菌或酵母菌为应用对象时，效果尤其显著。本专利技术方法应用对象中所述细胞样品可以为海拉细胞、红细胞、动物肝细胞等组织细胞；针对所述海拉细胞、红细胞、动物肝细胞等组织细胞，步骤S2所述超声处理的超声功率优选为80W～180W，超声时间优选为10～40min。更优选地，步骤S2所述超声功率为120W～180W，超声时间为30～40min。最优选地，步骤S2所述超声功率为160W～180W，超声时间为30～40min。本专利技术方法应用对象中所述细胞样品可以为黑曲霉、大肠杆菌或酵母菌等细菌的细胞。针对所述黑曲霉、大肠杆菌或酵母菌等细菌的细胞，步骤S2所述超声处理的超声功率优选为80W～180W，超声时间优选为10～40min。更优选地，步骤S2所述超声功率在80W～180W条件下，超声时间优选为30～40min；步骤S2所述超声功率在160W～180W条件下，超声时间优选为10～40min。本专利技术方法应用对象中当处理的细胞样品为海拉细胞，其细胞样品的预处理优选按照以下方法步骤进行处理：预处理包括消化、中和、离心收集和重悬处理步骤；所述消化是往海拉细胞中加入0.25％(m/v)胰酶，混匀，置于37℃孵箱中消化5～6min；所述中和是观察海拉细胞被完全消化后，加入DMEM(L)培养液终止消化，反复吹打混匀；所述离心收集是配平后在200×g条件下离心处理3min，收集离心处理后的中和液；所述重悬是将新的DMEM培养液加入离心收集的中和液，反复吹打使细胞充分混匀。本专利技术方法应用对象中所述细胞样品为红细胞，所述超声处理的超声功率优选为160W～200W；超声时间为10～40min。其细胞样品的预处理方法是取抗凝血加等量血生理盐水，混匀，2000r/min离心5min，去上清；用无Ca2+、Mg2+Hanks液将红细胞洗涤3次，前2次2000r/min，时间分别为5min，末次2000r/min，时间为10min；去上清，将压积红细胞配成所需浓度即得。本专利技术方法应用对象中所述细胞样品为动物肝细胞，其细胞样品的预处理方法是取动物肝脏样品，将洗脱的肝组织剪碎放入匀浆器中，加入冷的TE缓冲液，进行充分研磨，制成匀浆液；取匀浆液加入等量PBS，离心弃上清，加入PBS复溶即得。本专利技术方法应用对象中所述细胞样品为黑曲霉，其细胞样品的预处理方法是将黑曲霉点植于灭菌平板本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种超声固相破碎细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.细胞样品经预处理，得到预处理样品；S2.将超声波经过超声波换能器后直接作用于盛放经步骤S1预处理的细胞样品的容器外壁，设置超声功率和超声时间，将经步骤S1预处理的细胞样品进行超声处理，超声处理后离心取上清；其中步骤S2所述超声处理的超声功率为40W～180W；超声时间为10～40min。

【技术特征摘要】
1.一种超声固相破碎细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.细胞样品经预处理，得到预处理样品；S2.将超声波经过超声波换能器后直接作用于盛放经步骤S1预处理的细胞样品的容器外壁，设置超声功率和超声时间，将经步骤S1预处理的细胞样品进行超声处理，超声处理后离心取上清；其中步骤S2所述超声处理的超声功率为40W～180W；超声时间为10～40min。2.根据权利要求1所述超声固相破碎细胞的方法，其特征在于，步骤S2所述超声处理的超声功率为80W～180W。3.根据权利要求1所述超声固相破碎细胞的方法，其特征在于，步骤S2所述超声处理的超声功率为160W～180W。4.根据权利要求1所述超声固相破碎细胞的方法，其特征在于，步骤S2所述超声处理的超声功率为180W。5.权利要求1至4任一项所述超声固相破碎细胞的方法的应用，其特征在于，应用于破碎组织细胞或细菌细胞。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述组织细胞为海拉细胞、红细胞或动物肝细胞；所述细菌为黑曲霉、大肠杆菌或酵母菌。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞样品为组织细胞，步骤S2所述超声处理的超声功率为80W～180W，超声时间为10～40min；步骤S2所述超声功率优选为120W～180W，超声时间优选为30～40min；步骤S2所述超声功率更优选为160W～180W，超声时间更优选为30～40min。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述细胞样品为海拉细胞，其细胞样品的预处理包括消化、中和、离心收集和重悬处理步骤；所述消化是往海拉细胞中加入0.25%（m/v）胰酶，混匀，置于37℃孵箱中消化5～6min；所述中和是观察海拉细胞被完全消化后，加入DMEM培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯剑，任百光，莫白自，陈天铭，梁家杰，杨尚明，张红波，
申请(专利权)人：广东体必康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44