本发明专利技术提供了一种基于亲水固相萃取技术的蟾蜍二烯内酯类化合物类分离纯化方法。采用键合两性离子基团的Click XIon亲水固相萃取柱联合半制备反相色谱柱选择性类分离蟾蜍二烯内酯类化合物的纯化方法。选取蟾蜍皮95%乙醇提取物反相色谱制备分离所得的一个馏分，采用Click Xion亲水固相萃取柱分成氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类组分和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类组分，通过反相色谱对两组分分别制备，共获得七个化合物。该方法可以实现氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物的类分离及高效制备，解决了两类化合物在反相柱上疏水性相似，洗脱窗口窄的问题，实现了类分离，并表现出较好的分离效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及赡餘二帰内醋类化合物的类分离纯化，具体地说是一种新型的亲水固 相萃取柱（ClickXIon)联合高效液相色谱选择性类分离赡餘二帰内醋类化合物的纯化制 备方法。该方法对氨基酸修饰的赡餘二帰内醋类化合物和非氨基酸修饰的赡餘二帰内醋类 化合物表现出较优的分离效果。
技术介绍
赡餘二帰内醋（bufadienolides)是一类C24留，并且在留体母核的C17位接有 目六元不饱和内醋环，该类化合物也常被称为赡餘二帰内醋。Liselotte.Krenn,Pieter S.Steyn和高慧敏等分别对赡餘二帰内醋类化合物具有的生物活性进行了综述。该些 活性主要包括局麻、强也、升压、NaVr-ATP酶抑制活性及抗肿瘤等作用（L.Krenn，B. Kopp,Bufadienolidesfromanimalandplantsources,Phytochemistry, 48(1998) 1-29. ；P.S.Steyn,FanieR.vanHeerden,Bufadienolidesofplantandanimalorigin,Nat. Prod.Rep, 15 (1998) 397-413. ；H.Gao,R.Popescu,B.Kopp,Z.Wang,Bufadienolidesand theirantitumoractivity,P^Jat-Procl.R巧.，28(2011)953-969.)。另外，此类赡餘二帰内 醋类成分中的许多化合物都具有较高的毒性和较严重的副作用，给使用者带来一定的安全 隐患，从而制约了此类制剂的使用（D.Wang,F.Qi,W.Tang,F.Wang,QiemicalConsti1:uents andBioactivitiesoftheSkinofBufobufogargarizansCantor,Chem. Biodivers. ,8(2011)559-567.)。从天然产物(赡餘皮、赡酥)中分离纯化是获得赡餘二帰内 醋单体的主要途径。由于赡餘二帰内醋类化合物数量多、结构复杂，常规的分离纯化方法较 为耗时、低效（L.Krenn,B.Kopp,Bufadienolidesfromanimalandplantsources,Phyto chemistry, 48 (1998) 1-29.)。由于氨基酸修饰的赡餘二帰内醋和非氨基酸修饰的赡餘二帰 内醋类化合物疏水性相似，在反相高效液相纯化制备时常常出现共流出现象，给分离纯化 带来一定的困难。因此，发展较为高效的方法从赡餘皮中分离出高纯度的赡餘二帰内醋类 化合物进而开展相关药理毒理方面的研究是十分迫切的。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于亲水固相萃取技术的赡餘二帰内醋类化合物类分离纯化 方法。 基于亲水条件下，氨基酸修饰的赡餘二帰内醋类化合物和非氨基酸修饰的赡餘二 帰内醋类化合物亲水性质的不同，我们采用亲水固相萃取柱联合半制备反相色谱柱发展了 一种选择性类分离赡餘二帰内醋类化合物的纯化方法。其中所述亲水色谱柱为两性离子柱 (ClickXIon，北京华谱新创科技有限公司）。流动相组成为己膳、甲醇、己醇、甲酸、己酸、H 氣己酸、水。采用线性梯度、台阶梯度或等度洗脱方式。选取赡餘皮95%己醇提取物反相色 谱制备分离所得的一个觸分，采用ClickXIon亲水固相萃取柱分成氨基酸修饰的赡餘二帰 内醋类组分和非氨基酸修饰的赡餘二帰内醋类组分，通过反相色谱对两组分分别制备，共 获得走个化合物，其中两个为氨基酸修饰的赡餘二帰内醋，另外五个为非氨基酸修饰的赡 餘二帰内醋。所述化合物的结构信息见式1、表1。【主权项】1. 一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离的纯化方法，其特征在于： 1) 蟾蜍皮乙醇提取物先经制备型RPLC分离，水（A)和甲醇（B)流动相体系；洗脱梯度 为体积浓度25% - 100%B(v/v);按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，每个组分浓缩至 干后备用； 2) 针对富含蟾蜍二烯内酯的组分F14,分离过程中F14组分对应的流动相中甲醇的体 积浓度为58. 3%-59. 6% ;采用ClickXIon亲水固相萃取柱对两类化合物进行类分离，固相 萃取条件：亲水固相萃取柱为两性离子固相萃取柱（ClickXI〇n，20g/60mL);淋洗条件为： 淋洗I:95% (v/v)乙腈-水或乙醇-水80mL，回收溶剂得F14-F1 ;淋洗2 :50% (v/v)乙 腈-甲酸水或乙醇-甲酸水80mL，（酸水体积浓度为0. 1%-0. 5%)回收溶剂得F14-F2 ; 3) 针对F14-F1和F14-F2,采用半制备反相色谱进行进纯化制备，色谱柱为XCharge C18柱；采用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液流动相体系，对蟾蜍二烯内酯类化合物进行选择 性地分离。2. 按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：固相萃取柱为含两 性离子的亲水固相萃取柱（ClickXIon)，采用台阶等度洗脱方式，对氨基酸修饰的蟾蜍二 烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物进行类分离。3. 按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯类分离方法，其特征在于：固相萃取操作参数如 下：色谱柱内径为IO-1000 mm;采用体积浓度85%-100%乙醇-水溶解或体积浓度90%-100% 甲醇-水溶解，蟾蜍皮95%乙醇提取物上样浓度为ImgAir1-IgAiL;上样量为lmL-400mL;流 速为 5-1000mL/min。4. 按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：色谱操作参数如下： 色谱柱内径为4. 6-100mm;采用体积浓度65%-80%甲醇-水溶解，蟾蜍皮95%乙醇提取物上 样浓度为lmg/mL-i-lg/mL;进样量为IiiL-40mL;流速为l-480mL/min;柱温为 10-60°C。5. 按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯固相萃取类分离方法，其特征在于：所述洗脱溶 剂流动相组成为乙臆_水或乙醇 -水体系。6. 按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：所述流动相组成为 乙腈-水、甲醇-水、乙醇-水。7. 按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：所述蟾蜍皮提取物 为50%-95% (V/V)乙醇回流提取物。8. 按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于： 1)蟾蜍皮50%-95% (V/V)乙醇提取物先经制备型RPLC分离，色谱条件：色谱 柱为碳十八柱（C18TDE柱）；水（A)和甲醇（B)流动相体系；洗脱梯度为0-7min， 体积浓度25% - 40%B; 7-60min,体积浓度40% - 65%B; 60-65min,体积浓度 65% - 100%B;65-75min, 100%B;流速为330mL/min;检测波长为300nm;其采用体积浓度65% 甲醇-水溶解，样品溶液浓度为440mg/mL，其采用体积浓度65%甲醇-水溶解；进样体积 为40mL;按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，共计22个组分，每个组分浓缩至干后备 用；针对组分F14 (分离过程中F14组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为58. 3%-59. 6%)， 采用含两性离子的ClickXIon亲水固本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离的纯化方法，其特征在于：1）蟾蜍皮乙醇提取物先经制备型RPLC分离，水（A）和甲醇（B）流动相体系；洗脱梯度为体积浓度25%→100%B（v/v）；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，每个组分浓缩至干后备用；2）针对富含蟾蜍二烯内酯的组分F14，分离过程中F14组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为58.3%‑59.6%；采用Click XIon亲水固相萃取柱对两类化合物进行类分离，固相萃取条件：亲水固相萃取柱为两性离子固相萃取柱（Click XIon，20g/60mL）；淋洗条件为：淋洗1：95%（v/v）乙腈‑水或乙醇‑水80mL，回收溶剂得F14‑F1；淋洗2：50%（v/v）乙腈‑甲酸水或乙醇‑甲酸水80mL，（酸水体积浓度为0.1%‑0.5%）回收溶剂得F14‑F2；3）针对F14‑F1和F14‑F2，采用半制备反相色谱进行进纯化制备，色谱柱为XCharge C18柱；采用乙腈‑水溶液或甲醇‑水溶液流动相体系，对蟾蜍二烯内酯类化合物进行选择性地分离。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，李晓龙，刘艳芳，张云，张秀莉，肖远胜，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。