食管鳞癌早期分子诊断标志物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及食管鳞癌早期分子诊断标志物及其应用。由于现有食管鳞癌诊断技术水平所造成的诊断不明确，很可能会导致部分早期食管鳞癌患者失去最佳的治疗机会，需要更准确的指标进行补充，运用分子生物学方法研究鉴定有效的分子标志物，是辅助现有临床诊断、指导临床干预和癌前预警的关键手段之一。本发明专利技术提供的食管鳞癌早期分子标志物mir‑1277及其成熟miRNA，为临床食管鳞癌的精准诊断提供了潜在基础，具有重要的实际应用价值。

Early molecular markers of squamous cell carcinoma of the esophagus and its application

The present invention relates to the early molecular diagnostic marker of esophageal squamous cell carcinoma and its application. The diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma diagnosis caused by existing technical level is not clear, it may lead to some early esophageal squamous cell carcinoma patients lose the best treatment opportunity, need more accurate indicators were added, using molecular methods of molecular biology research to identify effective marker assisted clinical diagnosis, guidance is existing key means of clinical intervention and cancer early warning one of the. The invention provides a molecular marker of early esophageal squamous cell carcinoma Mir 1277 and mature miRNA, provide a potential basis for accurate clinical diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma, which has important practical application value.

【技术实现步骤摘要】
食管鳞癌早期分子诊断标志物及其应用
本专利技术涉及基因检测领域，具体的涉及食管鳞癌早期分子诊断标志物及其在临床诊治中的应用，更具体的涉及mir-1277及其成熟miRNA在制备食管鳞癌诊断制剂中的应用。
技术介绍
食管癌是人类常见的十大恶性肿瘤之一，我国是食管癌高发的国家之一，尤其是食管鳞癌(ESCC)为我国食管癌的主要病理类型。食管鳞癌的发生经历从正常食管粘膜、炎症、食管粘膜上皮异型增生、原位癌、粘膜内癌、早期浸润癌、晚期癌的过程。食管癌起病隐匿，许多患者早期阶段无任何症状，50％以上患者在确诊时己无法切除或己出现影像学可见的转移灶，中晚期患者术后5年整体生存率多年以来一直徘徊在10％左右。如能找到精确的诊断方法患者及时进行干预，并防止对低危组患者过度治疗，从而延长手术患者的寿命。研究表明通过对接受手术切除的早期食管鳞癌患者的长期随访，发现5年总体生存率可高达百分之八十以上。因此，早诊早治对于降低食管鳞癌的死亡率更为关键。目前可应用于食管鳞癌早期诊断的影像学方法有食管钡餐造影、计算机断层扫描和核磁共振成像，内镜技术有高放大倍数高分辨率内镜、色素内镜、窄谱成像内镜、自体荧光成像内镜、激光共聚焦内镜、光学连续X线断层扫描内镜、以及影像学与内镜相结合的内镜超声，病理细胞学方法有食管拉网脱落细胞学检查。这些方法各具优点，但同时也各显示有某方面的不足。由于技术水平所造成的诊断不明确，很可能会导致部分早期食管鳞癌患者失去最佳的治疗机会。上述现状充分表明，目前食管鳞癌的诊断方法，尤其是对术后患者的预后风险分层、早期癌精确诊断以及癌前病变癌变风险预警，需要更准确的指标进行补充。运用分子生物学方法研究鉴定有效的分子标志物，是辅助现有临床诊断、指导临床干预和癌前预警的关键手段之一。本专利技术对3例发生转移的食管鳞癌组织、3例未发生转移的食管鳞癌组织及6例癌旁组织的样本进行转录组测序，并运用生物信息学方法进行分析，找到一些与食管鳞癌相关的分子标志物，其中miR-1277-5p在癌组织中的表达量高于癌旁组织，进一步，荧光定量PCR实验结果与高通量测序结果一致。本专利技术为临床食管鳞癌的精准诊断提供了潜在的分子标志物，具有重要的实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种治疗食管癌药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：(a)化合物或组合物，所述化合物下调mir-1277和/或其成熟miRNA的转录和/或抑制mir-1277和/或其成熟miRNA的活性；(b)药剂学上能接受的载体。所述mir-1277序列见SEQIDNO1：accucccaaauauauauauauauguacguauguguauauaaauguauacguagauauauauguauuuuugguggguuu，其成熟miRNA为miR-1277-5p和miR-1277-3p，序列见SEQIDNO2：aaauauauauauauauguacguau和SEQIDNO3：uacguagauauauauguauuuu。进一步，采用反义寡核苷酸、miRNAinhibitor、antagomiRs、miRNA海绵、miRNAErasers、TargetMasking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调mir-1277和/或其成熟miRNA的转录和/或抑制mir-1277和/或其成熟miRNA的活性。进一步，药物组合物抑制食管鳞癌细胞的生长。本专利技术的目的在于提供上述药物组合物在治疗食管鳞癌中的应用。进一步，miRNAinhibitor序列见SEQIDNO6。本专利技术的目的在于提供一种食管癌诊断试剂，所述诊断试剂检测样本中mir-1277和/或其成熟miRNA的表达情况。进一步，食管癌包括食管鳞癌和食管腺癌，优选为食管鳞癌。所述的样本为肿瘤组织或外周血。进一步，食管鳞癌诊断试剂基于高通量测序方法和/或基因芯片法和/或定量PCR方法和/或探针杂交方法检测样本中mir-1277和/或其成熟miRNA的转录情况。高通量测序方法主要是指454lifesciences公司、ABI公司和illumina公司推出的二代测序技术以及helicosheliscopeTM和pacificbiosciences的单分子测序技术。优选采用二代测序方法、单分子测序方法、northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中mir-1277和/或其成熟miRNA的转录。优选的，所述的用于定量PCR方法包括特异性扩增mir-1277和/或其成熟miRNA的引物；所述的基于探针杂交方法包括与mir-1277和/或其成熟miRNA的核酸序列杂交的探针。进一步，加尾法扩增miR-1277-5p的引物为序列SEQIDNO4：aaatatatatatatatgtacgtat。本专利技术的目的还在于提供上述mir-1277和/或其成熟miRNA在制备食管鳞癌诊断工具中的应用。定义：miRNA是一类内源性、高度保守的、长度大约为22个核苷酸的非编码小分子RNA。miRNA通过其5'端可以与靶基因的3'端非翻译区(3'UTR)特异性结合，在转录后水平发挥调控作用。当miRNA与靶基因3'UTR以碱基完全互补配对的方式结合会引起靶mRNA的降解，而通过非完全互补配对结合的方式则会抑制mRNA的蛋白翻译。近年来，循环miRNA作为各类疾病标志物的研究备受关注。循环miRNA是指存在于血清、血浆、一些体液如唾液、尿液和脑脊液中，游离于组织外的miRNA的统称。循环miRNA作为一个较新且有前景的研究领域，近几年关于其作为肿瘤诊断标志物的研究成为热点。现阶段检测miRNA的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基因芯片、基于核苷酸杂交和基于PCR的miRNA检测方法。基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测法，不需要对样本RNA进行预扩增，包括northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。(1)Northern杂交又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定miRNA样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶miRNA序列互补的DNA探针，然后与经过标记的样本miRNA杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。(2)miRNA表达谱芯片原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上miRNA基因及内参序列，可精确分析出样品中相应miRNA的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。Luminex公司研制的液相芯片(Liquidchip)又称多功能悬浮点阵(Multianalytesuspensionarray，MASA)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗食管癌药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：(a)化合物或组合物，所述化合物下调mir‑1277和/或其成熟miRNA的转录和/或抑制mir‑1277和/或其成熟miRNA的活性；(b)药剂学上能接受的载体。

【技术特征摘要】
1.一种治疗食管癌药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：(a)化合物或组合物，所述化合物下调mir-1277和/或其成熟miRNA的转录和/或抑制mir-1277和/或其成熟miRNA的活性；(b)药剂学上能接受的载体。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，采用反义寡核苷酸、miRNAinhibitor、antagomiRs、miRNA海绵、miRNAErasers、TargetMasking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调mir-1277和/或其成熟miRNA的转录和/或阻断mir-1277和/或其成熟miRNA的活性。3.根据权利要求1-2所述的药物组合物在治疗食管鳞癌中的应用。4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，miRNAinhibitor序列见SEQIDNO6。5.一种食管癌诊断试剂，所述食管癌诊断试剂能够检测样本中mir-1277和/或其成熟miRNA的表达情况。6.根据权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：任静，宋宏涛，石小峰，
申请(专利权)人：北京泱深生物信息技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11