一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP引物和方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP引物和方法。所述引物包括外引物对Ho‑F3和Ho‑B3，以及内引物对Ho‑FIP和Ho‑BIP，序列分别如SEQ ID NO.1～4所示，并以该引物建立了LAMP检测方法。本发明专利技术为水稻潜根线虫的快速检测鉴定和早期诊断提供了一个新的检测方法，特异性强、准确性高、灵敏度高，且操作简便、快速高效、简便易行、成本低、判定直观，实用性强、应用性广，结果稳定性强、可信度高，而且还可以直接检测混有不同种类的线虫样品中和植物组织样品中的水稻潜根线虫，无需样品分离，对进出境口岸和调运检疫以及田间病害早期诊断和监测工作中的水稻潜根线虫快速检测鉴定具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP引物和方法
本专利技术属于植物病原分子检测鉴定
更具体地，涉及一种用LAMP引物和技术快速检测鉴定水稻潜根线虫的方法。
技术介绍
水稻是主要的粮食作物，潜根属HirschmanniellaLuc&Goodey,1964下的很多种类是水稻根部线虫病害中最重要的病原线虫，在根系内迁移危害，其中分布最广、为害最大的种类是水稻潜根线虫H.oryzae(vanBredadeHann,1902)Luc&Goodey,1963。因此，水稻潜根线虫的检测鉴定对于相关病害的防治具有重要的意义。水稻潜根线虫的形态学鉴定主要根据头部特征，口针基部球形状，排泄孔位置，肠是否覆盖直肠，尾部形态，侧区的形态特征和虫体体环类型，以及雌虫的阴门和雄虫的抱片形态特征。这些特征需要用高倍显微镜才可以观察到，并且幼虫不适用于用形态学方法鉴定，单以雄虫的形态特征也不能鉴定到种。此外，潜根属的形态常受到环境和地理条件的影响，通过形态学特征已难以区分潜根属所有种类。因此，研究和使用分子生物学方法快速准确的检测鉴定水稻潜根线虫是非常有必要的。目前对于潜根属线虫的分子序列信息研究尚少，GenBank数据库中仅仅保存了10个种的序列。有研究报道了水稻潜根线虫的PCR检测方法，设计了水稻潜根线虫的特异性引物，利用PCR技术对水稻潜根线虫进行分子鉴定，该方法虽然具有准确、灵敏的特性，但需要用精密而昂贵的RCR仪，检测过程复杂、时间较长，结果必须通过琼脂糖凝胶电泳检测才可以判定，不能满足口岸和调运等基层检疫以及田间监测的需求。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有水稻潜根线虫检测鉴定技术的缺陷和不足，为水稻潜根线虫快速检测鉴定提供一组LAMP引物和新的简便实用的检测方法，达到准确、灵敏、高效、简便和快速鉴定的目的。本专利技术的目的是提供一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP引物。本专利技术另一目的是提供一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP引物组，包括外引物对Ho-F3和Ho-B3，以及内引物对Ho-FIP和Ho-BIP，序列分别如SEQIDNO.1～4所示。所述述LAMP引物组在检测鉴定水稻潜根线虫方面的应用，以及在制备水稻潜根线虫的检测鉴定试剂或试剂盒方面的应用，也都应在本专利技术的保护范围之内。一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP方法，以待测样本DNA为模板，利用上述LAMP引物组进行LAMP扩增。优选地，所述LAMP扩增的反应体系为：10×ThermopolBuffer2.5μL、引物25倍混合液2μL、10mmol/LdNTPs3.5μL、100mmol/LMgSO41.5μL、8U/μLBstDNA聚合酶1μL、模板DNA1μL、ddH2O补足25μL；其中，引物25倍混合液包括40μM引物Ho-FIP、40μM引物Ho-BIP、5μM引物Ho-F3、5μM引物Ho-B3。优选地，所述LAMP扩增的反应条件为：57℃温育45min，85℃保5min。另外，LAMP扩增的结果判定方法可以为琼脂糖凝胶电泳法或SYBRGreenI染色目测法：所述琼脂糖凝胶电泳法为：将LAMP扩增产物使用1%琼脂糖凝胶在5～10V/cm电压下电泳25min，若出现LAMP特征性阶梯状条带，则判定为样本中有水稻潜根线虫；所述SYBRGreenI染色目测法为：在LAMP扩增产物中加入SYBRGreenI染料，若观察到绿色荧光，判定为样本中有水稻潜根线虫。一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP试剂盒，包含有上述LAMP引物组。优选地，所述试剂盒还含有SYBRGreenI染料。优选地，所述试剂盒还含有10×ThermopolBuffer、10mmol/LdNTPs、100mmol/LMgSO4、8U/μLBstDNA聚合酶、ddH2O。优选地，所述试剂盒使用时的LAMP扩增反应体系和反应条件如上文所述。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP引物和方法，具有如下优势：（1）特异性强、准确性高：本专利技术设计的水稻潜根线虫LAMP引物中的1对外引物和1对内引物对水稻潜根线虫ITS核糖体RNA序列中的6个不同区域进行识别扩增，若6个区域中的任何区域与引物不匹配都不能进行核酸扩增，因此相对于PCR引物只对靶序列的2个不同区域进行识别扩增而言，水稻潜根线虫LAMP检测的特异性大大提高，假阳性的概率则随之大大降低，因此检测的准确性大大提高。（2）检测灵敏度高：本专利技术建立的水稻潜根线虫LAMP检测方法的检测灵敏度达到1/1000单条虫DNA。而传统的形态学检测鉴定需要需要多条雌虫；已报道的水稻潜根线虫PCR检测方法也只检测了一条线虫DNA。因此本专利技术的检测灵敏度更高。（3）检测高效、快速、简便易行：本专利技术建立的水稻潜根线虫LAMP检测方法所用检测时间仅需45min，而传统的形态学检测鉴定需要几天时间。；已报道的水稻潜根线虫PCR检测方法则需要数小时。而且本专利技术的方法可以检测混有不同种类的线虫样品中和植物组织样品中的水稻潜根线虫，省去了传统形态学鉴定和已有PCR检测方法所要求的样品分离步骤，从而节省了大量时间和工作量。本专利技术建立的LAMPSYBRGreenI染色法，只需恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行，用肉眼观察颜色变化就可判定结果，省去了昂贵的仪器设备和繁琐的操作过程。因此本专利技术的检测效率大大提高，操作非常简单、易行，大大降低了检测成本。（4）结果稳定性强、可信度高：本专利技术设计的水稻潜根线虫LAMP引物对水稻潜根线虫的不同发育期（幼虫、雌虫和雄虫）、来源不同的2个水稻潜根线虫群体以及形态和生物学特性相对近似的2个目5个属6种其他植物线虫进行了测试验证，保证了该方法的检测结果具有充分的稳定性和可信度。（5）实用性强，应用性广：本专利技术建立的水稻潜根线虫LAMP检测方法不仅可以检测雌虫，而且可以检测幼虫和雄虫，克服了传统的形态学方法只能检测鉴定雌虫的缺陷；本方法还可以直接检测混有不同种类的线虫样品中和植物组织样品中的水稻潜根线虫，无需传统形态学鉴定和已有PCR检测方法所要求的样品分离步骤。因此，本专利技术建立的对水稻潜根线虫进行LAMP检测的引物和方法为水稻潜根线虫的进出境检疫和调运检疫以及田间病害早期诊断和监测提供了准确、快速和易行的方法，对提高水稻潜根线虫的检出率和防控效果具有重要意义。附图说明图1为水稻潜根线虫LAMP引物特异性电泳检测结果；其中A为水稻潜根线虫LAMP电泳检测结果，B为水稻潜根线虫SYBRGreenI染色反应结果；其中M为Maker2000，CK为空白对照，1和2为水稻潜根线虫HNX和HHN种群，4、5和6为尖突潜根线虫HQY、HYJ和HJM种群。图2为水稻潜根线虫LAMP引物特异性电泳检测结果；其中A为水稻潜根线虫LAMP电泳检测结果，B为水稻潜根线虫SYBRGreenI染色反应结果；其中M为Maker2000，CK为空白对照，1为水稻潜根线虫，2为尖突潜根线虫，3为玉米短体线虫，4为水稻干尖线虫，5为香蕉穿孔茎线虫，6和7为腐烂茎线虫和拟禾本科根结线虫。图3为水稻潜根线虫不同发育期单一个体D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP引物组，其特征在于，包括外引物对Ho‑F3和Ho‑B3，以及内引物对Ho‑FIP和Ho‑BIP，序列分别如SEQ ID NO.1～4所示。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP引物组，其特征在于，包括外引物对Ho-F3和Ho-B3，以及内引物对Ho-FIP和Ho-BIP，序列分别如SEQIDNO.1～4所示。2.权利要求1所述LAMP引物组在检测鉴定水稻潜根线虫方面的应用。3.权利要求1所述LAMP引物组在制备水稻潜根线虫的检测鉴定试剂或试剂盒方面的应用。4.一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的LAMP方法，其特征在于，以待测样本DNA为模板，利用权利要求1所述LAMP引物组进行LAMP扩增。5.根据权利要求4所述的LAMP方法，其特征在于，所述LAMP扩增的反应体系为：10×ThermopolBuffer2.5μL、引物25倍混合液2μL、10mmol/LdNTPs3.5μL、100mmol/LMgSO41.5μL、8U/μLBstDNA聚合酶1μL、模板DNA1μL、ddH2O补足25μL；其中，引物25倍混合液包括40μM引物Ho-FIP、40μM引物Ho-BIP、5μM引物Ho-F3、5μM引物Ho-B3。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐春玲，刘淑婷，韩玉春，丁善文，赵立荣，谢辉，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44