一种生物酶法去消旋化制备L‑草铵膦的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物酶法去消旋化制备L‑草铵膦的方法，该方法以D,L‑草铵膦为原料，经酶催化体系催化获得L‑草铵膦，所述酶催化体系由D‑氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶和辅酶再生系统组成。本发明专利技术方法以外消旋D,L‑草铵膦为原料，利用D‑氨基酸氧化酶将D‑草铵膦氧化为2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸，L‑草铵膦因不参与反应而被完全保留；而2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸又被氨基酸脱氢酶催化还原为L‑草铵膦，进而实现了D,L‑草铵膦的原位去消旋化，得到的L‑草铵膦中无其他副产物，产品总收率≥99％，光学纯度可超过99％。

【技术实现步骤摘要】
一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法；具体地说，是关于一种生物催化法拆分草铵膦消旋混合物制备光学纯L-草铵膦的方法。
技术介绍
草铵膦，也称草丁膦，英文名为：Phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸。草铵膦是由Hoechst公司于80年代开发的(后归属于拜耳公司)广谱灭生性除草剂。众所周知，灭生性除草剂市场巨大，占整个除草剂市场的六七成，尤其是在热带、亚热带地区，使用量巨大。目前，世界三大除草剂分别为草甘膦、百草枯和草铵膦。在市场使用量方面，草甘膦独占鳌头，近年来全球年使用量在85万吨左右；百草枯紧随其后，2015年的市场份额10万吨左右；而目前草铵膦产量很小，2015年国内产能只有0.6-0.7万吨。然而，前两大除草剂都遇到了极大的问题：草甘膦的长期大量使用，一是造成大量杂草产生抗性，使草甘膦趋于失效；二是造成严重水土流失和土壤板结；百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，全球越来越多国家禁用或限用，中国农业部等多部委联合发布的1745号公告已说明，百草枯水剂在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用。百草枯退市后，其国内近5万吨的市场空白将极有可能被草铵膦替代。更重要的是，草铵膦乃全球第二大转基因作物的耐受除草剂，使用量仅次于草甘膦，由于作用机理不同，可除去对草甘膦产生抗性的杂草。随着转基因技术的发展，抗草铵膦作物的种类和种植面积会进一步增多，草铵膦完全有可能与草甘膦并驾齐驱，甚至成为除草剂中的第一大品种。草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有植物毒性，除草活性为外消旋混合物的2倍，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。但目前大规模工业化生产的的草铵膦都是外消旋混合物，产品中的一半是不起药效作用的D-草铵膦，这极大降低了生产草铵膦的原子经济性、增加了生产成本、增大了环保压力。拆分草铵膦消旋混合物并将其中的D-草铵膦加以再利用，具有重要的市场前景和社会价值。现有拆分消旋混合物的方法主要分为化学手性拆分和生物催化手性拆分。化学手性拆分法是通过化学合成外消旋D,L-草铵膦或其衍生物，再利用手性拆分试剂，进行D型和L型异构体的分离，从而制得光学纯的L-草铵膦。1998年，Hoechst公司报道了草铵膦消旋体的化学拆分法。将草铵膦消旋体与奎宁成盐后结晶，过滤洗涤后得到高纯度的L-草铵膦酸奎宁盐，再用氨中和得到L-草铵膦。收率最高为86％，e.e.值最高为99％(美国专利US5767309)。但化学法拆分工艺存在以下缺点，一是需要使用昂贵的手性拆分试剂，二是D-草铵膦需要重新消旋再利用，三是单次拆分收率不超过50％，需要多次拆分才能达到高收率，工艺过程复杂而不利于大规模工业化生产。生物催化手性拆分法是一般是通过化学合成外消旋D,L-草铵膦或其衍生物，再利用特定的酶选择性催化某一构型的反应，获得其中一个光学异构体，未反应的另一个异构体衍生物经过分离、再消旋后、再进行酶催化反应。美国专利(US8981142)利用腈水解酶(图1)，水解10g/L的2-氨基-4(羟基乙基磷酰基)-丁氰，30℃反应24h，转化率为21％，但未测定产物的光学纯度。中国专利(CN103275896)以外消旋的2-氨基-4(羟基甲基磷酰基)-丁氰为底物，同样利用腈水解酶，30℃反应24h，得到L-草铵膦的光学纯度为95％，转化率未知。美国专利(US6686181-B1，US5756800)利用乙酰氨基水解酶(图2)，水解N-苯乙酰草铵膦制备L-草铵膦，L-构型N-苯乙酰草铵膦转化率83％，产品ee值66％。美国专利(US5618728)酰胺酶(图3)，利用酰胺酶制备L-草铵膦的方法。他们利用从土壤中筛选到的Enterobacteraerogenes9164L-酰胺酶水解(R,S)-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺制备得到L-草铵膦，同时释放NH3；28℃下振荡15h，转化液中L-草铵膦的ee值为95.7％。这类生物拆分工艺存在明显的缺陷：首先，需要合成草铵膦衍生物，再进行酶催化反应，而不是直接拆分D,L-草铵膦；其次，L-草铵膦与未反应的D-构型衍生物难以分离，产品光学纯度不高；再者，D-构型衍生物分离后还是需要再消旋化、进行循环拆分，导致工艺过程复杂、产品收率低，与化学法拆分相比并不具有优势。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种全新的拆分消旋混合物制备L-草铵膦的方法。该方法原料转化率高、分离精制过程简单、产品收率高、生产成本低，易于工业化。具体的，本专利技术提供的技术方案如下：一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法，以D,L-草铵膦为原料，经酶催化体系催化获得L-草铵膦，所述酶催化体系由D-氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶和辅酶再生系统组成。具体原理为：采用一锅化的多酶催化体系，以外消旋D,L-草铵膦为原料，利用D-氨基酸氧化酶将D-草铵膦氧化为2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，L-草铵膦不参与反应而完全保留；接着，2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸被氨基酸脱氢酶催化还原为L-草铵膦，从而实现D,L-草铵膦的原位去消旋化，得到光学纯的L-草铵膦。氨基酸脱氢酶在实现催化作用时需要NADH或NADPH作为辅酶，反应后生成NAD+或NADP+；由于辅酶价格昂贵，所以需要辅酶再生系统再生NAD(P)+为NAD(P)H。反应原理见附图4。为获得本专利技术方法所需的对D-草铵膦有催化作用的D-氨基酸氧化酶，构建一个D-氨基酸氧化酶酶库，该酶库的构建步骤为：(1)通过已知常用的D-氨基酸氧化酶基因序列，如来源于红酵母(Rhodotorulagracilis)ATCC26217的D-氨基酸氧化酶(RgDAAO)，从NCBI数据库中筛选与RgDAAO相似度较高的基因序列；(2)将上述D-氨基酸氧化酶的基因序列，经密码子优化后送基因合成公司进行全基因合成；(3)将合成的基因克隆到重组表达质粒上；(4)重组质粒经测序验证无误后转入表达宿主大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，构建成功重组菌。从构建的D-氨基酸氧化酶酶库中筛选得到来源于粗糙脉孢菌的D-氨基酸氧化酶对D-草铵膦有催化活力。具体的，所述D-氨基酸氧化酶来源于粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)OR74A，NCBI登录号为XP_964990.2，氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。作为优选，所述氨基酸脱氢酶为谷氨酸脱氢酶，来源于Pseudomonasentomophilastr.L48、PseudomonasputidaKT2440或BordetellaprtriiDSM12804，NCBI登录号依次为WP_044487662.1、NP_742836.1或WP_012247444.1。本专利技术中，所述辅酶再生系统为：以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)+的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统；以醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)+的醇脱氢酶辅酶再生系统；或者，以甲酸脱氢酶为辅酶再本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物酶法去消旋化制备L‑草铵膦的方法，以D,L‑草铵膦为原料，经酶催化体系催化获得L‑草铵膦，其特征在于，所述酶催化体系由D‑氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶和辅酶再生系统组成。

【技术特征摘要】
1.一种生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法，以D,L-草铵膦为原料，经酶催化体系催化获得L-草铵膦，其特征在于，所述酶催化体系由D-氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶和辅酶再生系统组成。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶来源于粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)OR74A。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶的NCBI登录号为XP_964990.2。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸脱氢酶为谷氨酸脱氢酶。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶来源于Pseudomonasentomophilastr.L48、PseudomonasputidaKT2440或BordetellaprtriiDSM12804。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅酶再生系统为：以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物、包含NAD(P)H和NAD(P)+的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统；或，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨立荣，周海胜，居述云，尹新坚，徐刚，吴坚平，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33