具改善骨质疏松作用的多肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种具改善骨质疏松作用的多肽及其制备方法和应用，属于天然活性产物技术领域。该多肽的制备方法包括以下步骤：脱脂：将鹿骨以CO

Polypeptides and their preparation methods and applications to improve the effect of osteoporosis

The invention relates to a polypeptide with the effect of improving the effect of osteoporosis and the preparation method and application of the polypeptide, and belongs to the technical field of natural active product. The preparation method of the polypeptide includes the following steps: degreasing: the deer bone is CO

【技术实现步骤摘要】
具改善骨质疏松作用的多肽及其制备方法和应用
本专利技术涉及天然活性产物
，特别是涉及一种具改善骨质疏松作用的多肽及其制备方法和应用。
技术介绍
骨质疏松是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，钙质由骨骼往血液净移动的矿物质流失，骨质量减少，骨骼内孔隙增大，出现中空疏松现象，导致骨质脆性增加和易于骨折的全身性骨代谢疾病，速度取决于破骨细胞和成骨细胞活性的消长。骨质疏松性骨折的发病率逐年增长，但目前对其发病机制及愈合方式尚不清晰，防治效果不理想，且再次骨折率高。临床上，将骨质疏松症分为两大类，分别为原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症，其中原发性骨质疏松症包括绝经后骨质疏松症和老年性肤质疏松症；继发性骨质疏松症是由疾病或药物等引起。现阶段对骨质疏松的药物治疗主要是钙剂、维生素D和骨吸收抑制剂(包括雌激素、选择性雌激素受体调节剂、双膦酸盐等)等三大类药。但研究表明，长期使用激素替代疗法会增加患乳腺癌、冠心病等疾病的几率，其他临床上使用的化学合成药物均存在一定的副作用。而鹿骨具有天然，多效，无毒等特点，鹿骨中寻找能够预防和/或治疗骨质疏松症的有效成分是迫切需要解决的课题。
技术实现思路
基于此，有必要针对上述问题，提供一种具改善骨质疏松作用的多肽，该多肽可通过调节骨代谢而增加骨质疏松大鼠的骨密度。一种具改善骨质疏松作用的多肽的制备方法，包括以下步骤：脱脂：将鹿骨以CO2超临界萃取的方式进行脱脂；研磨：将上述脱脂后的鹿骨通入液氮进行研磨，得骨粉；提取蛋白：将上述骨粉置于Tris-HCl缓冲溶液中，在15-30℃下以匀浆器研磨提取热不稳定性蛋白，待用；再将骨粉置于Tris-HCl缓冲溶液中，在100-150℃、0.1-0.2MPa的条件下提取热稳定性蛋白，待用；蛋白纯化：将上述热不稳定性蛋白和热稳定性蛋白混合，以葡聚糖凝胶柱纯化，得到平均分子量为15-19KD的鹿骨蛋白；发酵：将上述鹿骨蛋白以乳酸菌进行发酵，得到平均分子量为5KD-10KD的鹿骨多肽，即得。上述制备方法，首先，选取鹿骨提取多肽，其中，鹿骨为鹿科动物梅花鹿或马鹿的骨。药用首载于《名医别录》，《本草纲目》记载：“鹿骨味甘，微热，无毒。主补内虚，续绝伤，补骨强筋，除风，久服耐老”。鹿骨中含有大量蛋白质、骨胶原、磷脂质、软骨素和磷蛋白，有益于骨形成，促进体内胶原蛋白及弹性蛋白的更新，延缓骨吸收，促进软骨内骨化等过程。并且，上述多肽的制备方法，先对鹿骨进行脱脂，可获得更干燥的原料粉末，并可增加其亲水性，使鹿骨中蛋白提取更充分。再对从鹿骨中提取得到的两种蛋白提取液进行发酵处理，并在发酵之后以超滤柱进行超滤，得到分子量大小集中在5KD-10KD的范围内的多肽。以该多肽作用于骨质疏松模型大鼠，对其骨密度增强具有非常好的促进作用。在其中一个实施例中，在所述脱脂步骤之前，还包括预处理步骤，所述预处理步骤为：取鹿骨，剔除非骨成分，清洗干净，粉碎至体积为1-2cm3的碎块。在其中一个实施例中，所述脱脂步骤中，CO2超临界萃取的条件为：压力为15-35MPa，温度为20-25℃，时间为100-140min，CO2流量为20L/min。以上述条件进行脱脂，具有非常好的脱脂效果。其中一个实施例中，所述提取蛋白步骤中，先将所述骨粉按照1g骨粉：10-20ml溶剂的料液比置于Tris-HCl缓冲溶液中，在15-30℃下以匀浆器研磨20min，3400-5000转/min离心15-25min，取上清液，重复提取2-3次，合并上清液，回收溶剂，得到热不稳定性蛋白，待用；再将骨粉按照1g骨粉：10-20ml溶剂的料液比置于置于Tris-HCl缓冲溶液中，在100-150℃的条件下提取1.5-2.5hr，3400-5000转/min离心15-25min，取上清液，重复提取2-3次，合并上清液，回收溶剂，得到热稳定性蛋白，待用。由于鹿骨中蛋白种类丰富，热稳定性不同，通过上述方式分别提取热不稳定蛋白和热稳定蛋白，可以更充分的利用鹿骨资源，更好的发挥鹿骨蛋白的作用。在其中一个实施例中，所述蛋白纯化步骤中，将所述热不稳定性蛋白和热稳定性蛋白按照质量比为1:0.5-1.5混合，以葡聚糖凝胶柱G-50纯化，得到平均分子量为15-19KD的鹿骨蛋白。在其中一个实施例中，所述发酵步骤中，将乳酸菌浓度为3.5×1010-4.5×1010个/mL的菌悬液按体积百分比为4-8％的量接种至鹿骨蛋白发酵培养基中进行培养，所述鹿骨蛋白发酵培养基通过以下方法制备得到：按照鹿骨蛋白2.5-3.5g/100ml，玉米粉0.15-0.25g/100ml，NaCl0.4-0.6g/100ml的浓度配制溶液，调节pH值为7.0，灭菌，即得。通过乳酸菌发酵过程中产生对人体有益的细菌素，乳酸菌发酵后产生的乳酸可提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和VD的吸收。且乳酸菌具有磷酸蛋白酶，能将乳中的α-酪蛋白分解成微细的奶酪脂肪肽和氨基酸等，从而提高了蛋白的消化吸收率；在其中一个实施例中，所述发酵步骤中，将乳酸菌接种至鹿骨蛋白发酵培养基后，于35-45℃，pH7-9，90r/min转速的条件下培养24-40h，发酵液经,4000-5000r/min离心15-25min，取上清液，通过超滤柱过滤，截留得到平均分子量为5KD-10KD的多肽，即得。将发酵条件控制在上述范围内，能够使乳酸菌活性最佳，获得较好的发酵效果，并且，采用上述发酵条件后，得到的活性多肽中，分子量在5KD-10KD范围内的多肽占多肽总量的80％-90％，分子量在低于5KD范围内的多肽占多肽总量的5％-8％，当多肽组合物中多肽分子量按照上述范围分布，具有最佳的调节骨代谢作用，并有最佳的增强骨质疏松大鼠骨密度的作用。本专利技术还公开了上述的具改善骨质疏松作用的多肽的制备方法制备得到的多肽。本法明还公开了上述的多肽在制备预防和治疗骨质疏松症的药物或保健食品中的应用。在其中一个实施例中，所述药物或保健食品的剂型为片剂、颗粒剂、硬胶囊、软胶囊、口服液、丸剂或滴丸。上述剂型可以采用本领域技术人员熟知的方法来进行药剂的制备。根据需要，可以加入各种药学上可接受的载体。所述的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。本专利技术的药剂在制备时，可选择的填充剂包括但不限于：淀粉、糖粉、磷酸钙、糊精、微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、甘露醇等；可选择的粘合剂包括但不限于：羧甲基纤维素钠、PVP-K30、羟丙基纤维素、淀粉浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、胶化淀粉等；可选择的崩解剂包括但不限于：干淀粉、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素等；可选择的润滑剂包括但不限于：硬脂酸镁、滑石粉、十二烷基硫酸钠、微粉硅胶等。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的具改善骨质疏松作用的多肽，按照特定的条件对鹿骨进行脱脂，液氮研磨中粉碎，能很好的保证有效成分的活性，并在提取特定蛋白后进行发酵，随后以超滤得到分子量主要集中在5KD-10KD范围内的多肽。该多肽对骨密度具有非常好的增强作用。因此，可将该多肽用于预防和/或治疗骨质疏松症中，也将会有显著疗效，从而产生巨大的社会效益和经济效益。并且，该多肽为动本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具改善骨质疏松作用的多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：脱脂：将鹿骨以CO2超临界萃取的方式进行脱脂；研磨：将上述脱脂后的鹿骨通入液氮进行研磨，得骨粉；提取蛋白：将上述骨粉置于Tris‑HCl缓冲溶液中，在15‑30℃下以匀浆器研磨提取热不稳定性蛋白，待用；再将骨粉置于Tris‑HCl缓冲溶液中，在100‑150℃、0.1‑0.2MPa的条件下提取热稳定性蛋白，待用；蛋白纯化：将上述热不稳定性蛋白和热稳定性蛋白混合，以葡聚糖凝胶柱纯化，得到平均分子量为15‑19KD的鹿骨蛋白；发酵：将上述鹿骨蛋白以乳酸菌进行发酵，得到平均分子量为5KD‑10KD的鹿骨多肽，即得。

【技术特征摘要】
1.一种具改善骨质疏松作用的多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：脱脂：将鹿骨以CO2超临界萃取的方式进行脱脂；研磨：将上述脱脂后的鹿骨通入液氮进行研磨，得骨粉；提取蛋白：将上述骨粉置于Tris-HCl缓冲溶液中，在15-30℃下以匀浆器研磨提取热不稳定性蛋白，待用；再将骨粉置于Tris-HCl缓冲溶液中，在100-150℃、0.1-0.2MPa的条件下提取热稳定性蛋白，待用；蛋白纯化：将上述热不稳定性蛋白和热稳定性蛋白混合，以葡聚糖凝胶柱纯化，得到平均分子量为15-19KD的鹿骨蛋白；发酵：将上述鹿骨蛋白以乳酸菌进行发酵，得到平均分子量为5KD-10KD的鹿骨多肽，即得。2.根据权利要求1所述的具改善骨质疏松作用的多肽的制备方法，其特征在于，在所述脱脂步骤之前，还包括预处理步骤，所述预处理步骤为：取鹿骨，剔除非骨成分，清洗干净，粉碎至体积为1-2cm3的碎块。3.根据权利要求1所述的具改善骨质疏松作用的多肽的制备方法，其特征在于，所述脱脂步骤中，CO2超临界萃取的条件为：压力为15-35MPa，温度为20-25℃，时间为100-140min，CO2流量为15-25L/min。4.根据权利要求1所述的具改善骨质疏松作用的多肽的制备方法，其特征在于，所述提取蛋白步骤中，先将所述骨粉按照1g骨粉：10-20ml溶剂的料液比置于Tris-HCl缓冲溶液中，在15-30℃下以匀浆器研磨20min，3400-5000转/min离心15-25min，取上清液，重复提取2-3次，合并上清液，回收溶剂，得到热不稳定性蛋白，待用；再将骨粉按照1g骨粉：10-20ml溶剂的料液比置于Tris-HCl缓冲溶液中，在100-150℃的条件下提取1....

【专利技术属性】
技术研发人员：苑广信，杜培革，郭冰洁，安丽萍，李洪宇，盛瑜，徐广宇，韩笑，孙晶波，王曼力，赵南晰，郭笑，
申请(专利权)人：北华大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22