本发明专利技术属于水生动物分子生物学技术领域，具体涉及中华鳖IGFBP1基因与生长相关单核苷酸位点的发现与应用。IGFBP1基因的多态性是根据中华鳖基因组中IGFBP1基因序列设计引物，以中华鳖的基因组DNA为模板扩增，扩增片段利用直接测序法筛选SNP，并利用ARMS PCR进行基因分型，发现第243bp处有一个A/G的碱基突变，利用该标记与大样本中华鳖群体的生长性状进行关联分析，并检测其在不同品系鳖中的情况。本发明专利技术为中华鳖标记辅助选择提供了新的分子标记。
【技术实现步骤摘要】
一种检测中华鳖IGFBP1基因片段中与生长相关单核苷酸位点的试剂盒及应用
本专利技术属于水生动物分子生物学
，涉及一种包含如SEQIDNO：1所示中华鳖基因核苷酸的核酸分子。本专利技术还涉及IGFBP1基因多核苷酸序列中的单核苷酸多态性位点和检测所述单核苷酸多态性位点的方法，以及该位点和中华鳖生长性状的关联分析。
技术介绍
动物的生长性状由于直接影响着水产动物的经济价值，已作为一个重要的经济性状成为当前研究的热点。提高生长速度可以直接降低养殖和劳动力投入，有利于经济效益的提高。因此，筛选具有优良生长性状的养殖品种，提高水产动物的生长性能，是水产养殖业长久以来的研究目标。传统的选育方法是依表型进行选择，周期长，效率低，因此需利用分子标记技术从基因型层面，筛选与经济性状相关分子标记，辅助选育，以提高育种效率。目前，比较直接快速的解决办法之一就是利用分子标记的方法筛选到与这些生长性状相关的基因或标记，从而进行遗传改良。胰岛素样生长因子(Insulin-iikegrowthfactors,IGFs)是一类具有胰岛素样代谢和促有丝分裂功能的蛋白质，是胚胎和动物出生后生长的主要决定因素。IGF介导生长激素的促生长作用。神经内分泌生长轴上的IGF系统包括两个配体(IGF-I、IGF-II)、两个IGF受体(IGF-IR、IGF-IIR)以及IGF结合蛋白(IGFBPs)，鱼类在内的脊椎动物的生长主要受胰IGFs信号通路的控制。胰岛素样生长因子结合蛋白1(Insulin-likegrowthfactorbindingpro-teins1,IGFBP1)的主要功能是对IGF-1进行结合运载和延长半衰期，并进行组织和细胞识别定位，调节IGFs通路的生物学功能。研究表明，IGFBP1在血液循环中的代谢变化最快，以磷酸化、部分磷酸化、非磷酸化等形式在不同时期的不同组织中以不同比例存在，磷酸化的IGFBP1增加了对IGF-1的亲和力，导致其与细胞表面的结合力下降，抑制其活性。此外，魏可鹏等(2012)在建鲤IGFBP1基因上找到了两个与增重相关的SNP位点，作为建鲤增重相关的分子标记应用于育种实践。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是找到在中华鳖生长中具有重要作用的IGFBP1基因上的单核苷酸多态性位点，并建立检测和分型的方法，将位点基因型与生长性状进行关联分析，为中华鳖生长标记辅助育种提供一种有用的分子标记。本专利技术要克服的主要技术问题为，针对现有技术的不足，提供一种检测中华鳖IGFBP1基因片段中与生长相关单核苷酸位点的试剂盒及应用。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：所述检测中华鳖IGFBP1基因片段中与生长相关单核苷酸位点的试剂盒包含如下引物：PCR扩增正向引物(上游外引物(FW))：5′-CCTGGATCTCCTGAATTGAA-3′(SEQIDNO.2)；PCR扩增反向引物(下游外引物(RW))：5′-GCCATTTCCCACTGATATTG-3′(SEQIDNO.3)；突变位点检测上游内引物(FN)：5’-CACTCATGGTAGGACTAAG-3’(SEQIDNO.4)；突变位点检测下游内引物(RN)：5’-ATGCTGGTCTAGATAATAT-3’(SEQIDNO.5)。其中，所述中华鳖IGFBP1基因片段序列如SEQIDNO.1所示，该序列的243bp处有1个A/G的碱基突变。检测中华鳖IGFBP1基因片段中与生长相关单核苷酸位点的方法包括如下步骤：(1)以中华鳖个体的DNA为模板，用上述PCR扩增正向引物和反向引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物，采用直接测序法比对得到SNP位点；(2)用上述突变位点检测上游内引物和下游内引物和PCR扩增正向引物和反向引物联合进行分型鉴定；(3)用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中AA、AG和GG基因型的分布。本专利技术所述的中华鳖IGFBP1基因片段可用于中华鳖分子标记辅助选择。还可用于制备检测生长相关试剂。下面对本专利技术作进一步说明：本专利技术将中华鳖转录组测序结果比对到中华鳖基因组数据库中，找寻IGFBP1基因上疑似存在的SNP。以中华鳖基因组为模板设计引物对疑似存在单核苷酸突变位点的片段进行扩增，并采用直接测序法，软件比对发现第243bp处确实存在一个SNP。确定位点真实存在之后，再采用四引物突变特异性扩增系统法(AmplificationRefractoryMutationsystem,ARMS)对位点进行分型，并在大群体样本中进行该位点不同基因型和中华鳖生长性状的关联分析。IGFBP1基因分子标记的筛选实验材料：取中华鳖裙边组织提取DNA，随机取样12只中华鳖个体。引物设计：将中华鳖转录组测序结果比对到中华鳖基因组数据库中，以含有SNP位点的序列为模板，运用Primerpremier6.0设计引物。设计引物的原则：长度为18-25bp，GC含量在40％-60％，退火温度在45-55℃之间。引物序列为：正向引物为5′-CCTGGATCTCCTGAATTGAA-3′，反向引物为5′-GCCATTTCCCACTGATATTG-3′，产物长度为640bp。具体操作：分别以12个中华鳖个体的DNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增。PCR反应体系(共25μL)：MIX12.5μL(含染液，InstantPCRKit3.0)，DNA模板(50ng/μL)1μL，上下游引物(10pmol/μL)各0.5μL，ddH2O10.5μL。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸7min，最后4℃保存。电泳：取5μLPCR产物点样于1.5％普通琼脂糖凝胶(含Gelstain)上，点5μLDL1,000bpDNAMarker作为参照。0.5V/cm电泳0.5h。电泳结束后于凝胶成像仪下观察扩增结果，如图1所示。将纯化后的PCR产物送铂尚生物公司进行测序，软件对比测序结果如图2。IGFBP1基因单核苷酸分型的方法建立实验材料：在同批次同池养殖中华鳖中随机取样245个个体。中国台湾鳖23个，黄沙鳖20个，日本鳖20个。以上全部个体均取裙边组织提取DNA。引物设计：根据四引物ARMSPCR扩增原理，在IGFBP1基因突变位点(A/G)设计一对特异性引物，并在突变位点两侧设计一对参照引物。上游内引物(FN)，5’-CACTCATGGTAGGACTAAG-3’，下游内引物(RN)，5’-ATGCTGGTCTAGATAATAT-3’；上游外引物(FW)，5′-CCTGGATCTCCTGAATTGAA-3′，下游外引物(RW)，5′-GCCATTTCCCACTGATATTG-3′(参考IGFBP1基因分子标记的筛选中的引物)。当基因型为A/A纯合时，扩增产物由引物FW、RW产生的640bp和引物FW、RN产生的261bp两条带组成；当基因型为G/G纯合时，扩增产物由引物FW、RW产生的640bp和引物FN、RW产生的416bp两条带组成；当基因型为G/A杂合时，扩增产物由引物FW、RW产生的640bp，引物FN、RW产生的416bp和引物FW、RN产生的261bp三条带组成。由上述外引物FW、RW对得到了含SNP的基因片本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测中华鳖IGFBP1基因片段中与生长相关单核苷酸位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含如下引物：PCR扩增正向引物：5′‑CCT GGA TCT CCT GAA TTG AA‑3′；PCR扩增反向引物：5′‑GCC ATT TCC CAC TGA TAT TG‑3′；突变位点检测上游内引物：5’‑CAC TCA TGG TAG GAC TAA G‑3’；突变位点检测下游内引物：5’‑ATG CTG GTC TAG ATA ATA T‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种检测中华鳖IGFBP1基因片段中与生长相关单核苷酸位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含如下引物：PCR扩增正向引物：5′-CCTGGATCTCCTGAATTGAA-3′；PCR扩增反向引物：5′-GCCATTTCCCACTGATATTG-3′；突变位点检测上游内引物：5’-CACTCATGGTAGGACTAAG-3’；突变位点检测下游内引物：5’-ATGCTGGTCTAGATAATAT-3’。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述中华鳖IGFBP1基因片段序列如SEQIDNO.1所示，该序列的243bp处有1个A/G的碱基突变。3.一种检测中华鳖IGFBP1基因片段中与生长相关单核苷酸位点的方法，其特征在于，所述方法包括如下步...
【专利技术属性】
技术研发人员：王晓清，曾丹，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43
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