一种MYLK4基因辅助检测牛生长性状的方法及其专用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种MYLK4基因辅助检测牛生长性状的方法及其专用试剂盒。以黄牛基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增获得黄牛MYLK4基因；PCR产物经限制性内切酶HhaI消化后，进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定黄牛MYLK4基因第61595位的单核苷酸多态性。本发明专利技术所阐述的方法能够检测黄牛MYLK4基因的单核苷酸多态性，可作为与牛生长性状密切相关分子遗传标记，用于牛的辅助选择和分子育种，加快良种牛繁育速度。

【技术实现步骤摘要】
一种MYLK4基因辅助检测牛生长性状的方法及其专用试剂盒
本专利技术属于分子遗传学领域，涉及黄牛基因单核苷酸多态性(SNP)作为分子遗传标记的筛选与检测，特别涉及一种检测黄牛MYLK4基因单核苷酸多态性的方法及应用。
技术介绍
所谓分子遗传标记，也就是DNA水平上遗传多态性的标记，它可以直接反映DNA序列上的遗传变异。因为其来源为DNA序列的差异，所以又叫分子标记，其在生物群体中具有遗传多样性高、稳定性强且受环境影响小的特点。分子标记辅助选择育种是现代动物分子育种的一项主要研究内容，其直接在DNA水平上对性状的基因型进行选择，因此其选种的准确性大大提高，克服了传统动物育种方法的缺陷。单核苷酸多态性(SNP)是一种重要的分子遗传标记，主要是指由于DNA序列中某个核苷酸的改变而引起的基因组水平上的序列多态性，形式主要为单个核苷酸的转换及颠换。SNP同其它分子标记相比，有覆盖基因组范围大、密度高、分辨率高、遗传稳定和易实现分析自动化等优点。因此被广泛地应用于生物学、植物学、医学、动物育种、生物进化等研究领域。自从Botestein等第一次提出了DNA限制性片段长度多态性的相关概念后，PCR-RFLP法就在SNP的检测中被大量使用。应用此方法的前提是SNP的位点必须含有合适的限制性内切酶识别的位点。利用限制性内切酶对目的片段进行切割，然后进行凝胶电泳分析，就能准确的鉴别SNP位点的基因型，是最经典的方法之一。肌球蛋白(myosin)是构成肌肉的重要蛋白，它是由两条重链(heavychain)，两条必需轻链(essentiallightchain)和两条调节轻链(regulatorylightchain，RLC)组成的六聚体。肌球蛋白具有ATP酶活性，与ATP结合后能够使其构象发生改变从而驱使肌丝滑动，引起肌肉的收缩。而肌球蛋白轻链激酶(myosinlightchainkinase，MYLK)能够使肌球蛋白调节轻链(RLC)磷酸化，从而激活或调节肌球蛋白ATP酶活性。研究表明，MYLK与细胞骨架改变有关，进而可能调节细胞的运动、分泌活动、上皮细胞通透性改变和血小板形态的改变；它还能促进轴突生长锥的伸长和细胞张力纤维的发生，进而影响胞质分裂和细胞的凋亡、修复。在生命活动和生长发育过程中发挥着重要作用。而MYLK4是MYLK家族成员之一，它是一种Ca2+/CaM非依赖性的组成型活性激酶。研究发现它可能是心肌细胞中RLC磷酸化的重要贡献者。目前，国内外对MYLK4基因多态性的研究主要集中于其与心血管疾病、肿瘤等的关联性研究，而对于家畜MYLK4基因单核苷酸多态性的研究尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种MYLK4基因辅助检测牛生长性状的方法及其专用试剂盒。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种黄牛MYLK4基因单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：以黄牛基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛MYLK4基因部分片段，将PCR扩增产物经限制性内切酶HhaI消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定黄牛MYLK4基因第61595位单核苷酸多态性位点的基因型；所述引物对P的序列为：上游引物F：5’-CGGACACTTGTTCTCAATCGGC-3’下游引物R：5’-GTGGTCTAGGAATCTGGGTG-3’。所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸25s，共36个循环；72℃延伸5min。所述琼脂糖凝胶电泳使用的是质量浓度3％的琼脂糖凝胶。所述黄牛MYLK4基因第61595位单核苷酸多态性位点的基因型的电泳结果为：AA基因型表现为208bp一条条带；AG基因型表现为208bp、185bp和23bp三条条带；GG基因型表现为185bp和23bp两条条带。上述黄牛MYLK4基因单核苷酸多态性的检测方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。上述黄牛MYLK4基因单核苷酸多态性的检测方法在辅助检测黄牛生长性状中的应用。所述生长性状选自体高或体斜长。所述黄牛选自秦川牛、皮南牛、夏南牛、南阳牛或柴达木黄牛。一种MYLK4基因辅助检测牛生长性状的专用试剂盒，包括用于进行基于PCR-RFLP法的MYLK4基因第61595位单核苷酸多态性位点分型的引物对P(序列如上所述)。本专利技术的有益效果体现在：针对上述第61595位的突变，本专利技术公开了检测方法，通过设计特定的引物，PCR扩增目的片段，然后用特定的限制性内切酶酶切鉴定，解决了传统的PCR-SSCP方法的繁琐和不稳定，能够简单、快速、低成本、精确度高的鉴定基因的单核苷酸多态性。本专利技术对突变位点的基因型进行了检测和基因频率分析，并将该位点与五个黄牛品种的生长性状进行关联分析。结果表明黄牛MYLK4基因第61595位为G或A的单核苷酸多态性，可作为分子遗传辅助育种的标记，从而为黄牛的分子标记辅助选择育种提供基础资料，加快中国黄牛的种质资源改良工作。附图说明图1为黄牛MYLK4基因第61595位(AC_000180.1：G61595A)的测序图：框出位置表示该位点。图2为黄牛MYLK4基因PCR扩增的208bp片段的电泳图。图3为黄牛MYLK4基因第61595位不同基因型PCR产物经HhaI酶切后电泳结果：M为MarkeⅠ，分别为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做详细的说明，所述实施例是对本专利技术的解释而不是限定。本专利技术根据黄牛MYLK4基因序列设计引物，分别以5种黄牛品种的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，产物测序得到黄牛MYLK4基因的部分序列。与NCBI上公布的参考序列比对，发现在黄牛MYLK4基因第61595位存在A>G的突变，利用PCR-RFLP方法对该突变进行检测。将黄牛MYLK4基因单核苷酸多态性与黄牛生长性状关联分析，证明其可为黄牛分子育种提供依据。一、黄牛MYLK4基因部分序列的克隆及其多态性检测1.样本采集及基因组DNA提取(1)血样的采集本专利技术采用了5个黄牛品种，共计535体作为检测对象，血液的采集方法为颈静脉采血。血样的采集地区，以及各品种的数据资料情况如表1所示。表1.实验动物情况(2)血样基因组DNA的提取①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃，12000rpm离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明。②在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。③加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清。④取出样品加入200μL的6mol/LNaCl，口底摇动15次使其充分混匀，在4℃下12000rpm离心10min，取上清液至2.0mL离心管中。⑤加Tris-饱和酚1mL，放置冰上温和摇动20min，使其充分混匀；4℃，12000rpm离心10min，将上层水相用移液器转入另一灭菌2.0mL离心管中。⑥加入0.5mL的Tr本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄牛MYLK4基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以黄牛基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛MYLK4基因部分片段，将PCR扩增产物经限制性内切酶HhaI消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定黄牛MYLK4基因单核苷酸多态性位点的基因型；所述引物对P的序列为：上游引物F：5’‑CGGACACTTGTTCTCAATCGGC‑3’下游引物R：5’‑GTGGTCTAGGAATCTGGGTG‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种黄牛MYLK4基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以黄牛基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛MYLK4基因部分片段，将PCR扩增产物经限制性内切酶HhaI消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定黄牛MYLK4基因单核苷酸多态性位点的基因型；所述引物对P的序列为：上游引物F：5’-CGGACACTTGTTCTCAATCGGC-3’下游引物R：5’-GTGGTCTAGGAATCTGGGTG-3’。2.根据权利要求1所述一种黄牛MYLK4基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸25s，共36个循环；72℃延伸5min。3.根据权利要求1所述一种黄牛MYLK4基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳使用的是质量浓度3％的琼脂糖凝胶。4.根据权利要求1所述一种黄牛MYLK4基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄永震，董艳鹏，郑立，宋海霞，贺花，董冬，宋成创，陈宏，雷初朝，党瑞华，蓝贤勇，胡沈荣，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61