一种K型小麦胞质雄性不育细胞质的鉴定方法技术

本发明专利技术提供一种K型小麦胞质雄性不育细胞质的鉴定方法，包括(1)提取K型小麦细胞质雄性不育系叶片基因组DNA；(2)利用内参标记引物进行叶片基因组DNA扩增检测；(3)以扩增成功的叶片基因组DNA为模板，利用AFLP标记引物，对小麦不同细胞质雄性不育系进行扩增，获得K型小麦雄性不育细胞质的特异条带并成功将其转化为SCAR标记用于K型小麦胞质雄性不育细胞质的鉴定。本发明专利技术创新之处在于避免了繁琐的线粒体DNA的提取过程，以小麦叶片基因组DNA为模板，利用小麦核基因组内参、叶绿体基因组内参和线粒体基因组内参进行小麦叶片基因组DNA质量检测，获得了K型小麦细胞质的AFLP标记，并成功转化为质量更高的SCAR标记，鉴定方法更加高效并且程序简化。

【技术实现步骤摘要】
一种K型小麦胞质雄性不育细胞质的鉴定方法
本专利技术属于生物工程
，涉及小麦雄性不育及其杂种优势利用技术，具体涉及一种K型小麦胞质雄性不育细胞质的鉴定方法。
技术介绍
杂种优势利用是提高作物产量的一个极为有效的途径。玉米、水稻和油菜等作物杂种优势利用已得到了广泛应用，并取得了举世瞩目的成就。许多研究和生产实践表明，小麦也具有明显的杂种优势，深入研究与开发利用是大幅度提高小麦产量的实效新途径。目前，利用雄性不育实现小麦杂种优势利用的途径主要有四种，即CMS(Cytoplasm-nucleusMaleSterility，质核互作型雄性不育)、CHA(ChemicalHybridizingAgents，化学杂交剂诱导雄性不育)、GMS(GenomicMaleSterility，核型不育)与PMS(Photo-thermo-sensitiveMaleSterility，光温敏不育，包括光敏、温敏和光温互作型不育)途径。其中，CMS途径被认为是最有应用前景的途径之一。小麦K型细胞质雄性不育系是指具有黏果山羊草(Ae.koschyi)细胞质的一种雄性不育系。根据细胞质效应和杂种F1的比较研究，Tsunewaki认为K型细胞质雄性不育系在小麦杂种优势利用中是最有前途的不育类型。研究细胞质雄性不育的分子机理对创建、鉴定和利用细胞质雄性不育系统，培育超高产杂交作物新品种具有重要的指导意义。目前研究表明，线粒体基因组是细胞质雄性不育胞质因子的主要载体，小麦细胞质雄性不育与线粒体有着十分密切的关系，线粒体基因组的变异性很可能涉及到不育系育性本质的改变，但是分析小麦K型细胞质雄性不育系时线粒体的基因组提取非常麻烦，不利于操作。
技术实现思路
鉴于现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种K型小麦胞质雄性不育细胞质的鉴定方法，通过叶片基因组DNA的提取，利用线粒体内参标记物，转化为线粒体DNA，操作简便，实用性强。为解决上述问题，本专利技术采用以下技术方案来实现：一种K型小麦胞质雄性不育细胞质的鉴定方法，包括如下步骤：(1)提取K型小麦细胞质雄性不育系叶片基因组DNA；(2)利用内参标记引物进行叶片基因组DNA扩增检测，检测其质量，保留扩增成功的叶片基因组DNA；(3)以扩增成功的叶片基因组DNA为模板，利用AFLP标记引物，对小麦不同细胞质雄性不育系进行扩增，获得K型小麦雄性不育细胞质的特异条带用于K型小麦胞质雄性不育细胞质的鉴定；所述AFLP标记引物为：E-AGG：5'-GACTGCGTACCAATTCAGG-3'；M-CTA：5'-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3'。将步骤(3)的特异条带回收、克隆、转化和测序，获得SCAR标记引物，对小麦不同细胞质雄性不育系进行扩增，获得K型小麦雄性不育细胞质的特异目标条带；所述SCAR标记引物为：5'-CCTTCCTGGCTATCAATC-3'；5'-TAACTAACTAAGTGCTGGC-3'。所述内参标记引物包括核基因组内参基因、线粒体基因组内参基因及叶绿体基因组内参基因。所述核基因组内参基因包括肌动蛋白β亚基基因。所述线粒体基因组内参基因包括细胞色素C氧化酶第三亚基基因。所述叶绿体基因组内参基因包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基基因。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术所述的方法，其创新之处在于避免了繁琐的线粒体DNA的提取过程，以小麦叶片基因组DNA为模板，利用小麦核基因组内参、叶绿体基因组内参和线粒体基因组内参进行小麦叶片基因组DNA质量检测，扩增成功表示质量高，确保下一步扩增可靠实现。(2)本专利技术获得了K型小麦细胞质的AFLP标记，并成功转化为质量更高的SCAR标记，并在其它小麦细胞质雄性不育系中得到验证，该鉴定方法更加高效并且程序简化。结果可用于黏型小麦细胞质雄性不育系分子标记辅助育种，也为小麦专一细胞质种性鉴定提供了技术支撑和理论依据。(3)采用的小麦雄性不育材料是采用亲本(A)-90-110和(A)-8222经多年回交转育而成的小麦不育系，核基因型相当一致，遗传相似度很高，得到的差异完全可认为是来自细胞质基因组的本质差异，可以用来鉴定黏类小麦细胞质雄性不育类型，同时也为进一步研究小麦核质互作雄性不育机理，甚或种性差异奠定了基础。附图说明图1、核基因β-actin内参基因PCR检测结果；图2、叶绿体Rabcl内参基因PCR检测结果；图3、线粒体细胞色素C氧化酶第三亚基(COXIII)内参基因PCR检测结果；图4、引物组合E8/M5的AFLP扩增；图5、SCAR标记YW1(A)和YW2(B)的扩增结果；图6、SCAR标记YW2的扩增结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明，不能认定本专利技术的具体实施只局限于这些说明。对于本专利技术所属
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本专利技术的保护范围。本专利技术以三个小麦不同细胞质类型的雄性不育系为材料，分别是K型不育系(粘果山羊草细胞质)K9和K8，Ven型不育系(偏凸山羊草细胞质)Ven9和Ven8(对比例)，B型不育系(二角山羊草细胞质)B9和B8(对比例)，以及两种保持系(对比例)，分别提取其叶片组DNA，并利用核基因组、线粒体基因组、叶绿体基因组3个内参基因进行质量检测。然后对其进行AFLP标记，并成功地将AFLP标记转化为质量更高的SCAR标记，获得K型小麦雄性不育细胞质的独特分子标记。实施例1本实施例提供一种K型小麦胞质雄性不育细胞质的鉴定方法，包括如下步骤：步骤1、提取各种细胞质雄性不育系(K型、Ven型和B型)叶片基因组DNA：(1)称取0.1g小麦叶片，液氮研磨后装入1.5mL离心管，加入500μL5N异硫氰酸胍溶液，反复混匀后室温静置5-10min。(2)离心机10000rpm，离心5min，将上清液移入另一支1.5mL离心管，再加入800μL4NNaClO4(PH5.2)溶液，反复混匀后室温静置5-10min。(3)加入15μL溶液RNaseA和40μLResin溶液，以去除RNA和其他杂质干扰，混匀后室温静置10min。(4)离心机10000rpm离心60S，弃上清。(5)加入400μL溶液4NNaClO4(PH5.2)，混匀，10000rpm离心3min，弃上清。(6)加入500μL洗液，用前加入45ml无水酒精，充分混匀，10000rpm离心1min，弃上清。(7)重复步骤(6)。(8)12000rpm离心3min，吸干上清，放置室温下晾干10min左右。(9)取溶液TEbuffer50μL混匀，40-50℃持续1-5min。(10)12000rpm离心3min，取上清即为叶片基因组DNA。利用内参标记引物检测叶片基因组DNA质量，步骤如下；内参基因的引物序列如下：(1)根据小麦细胞核基因组内参肌动蛋白β亚基(β-actin)基因，设计一对引物：5'-CATAAAGGAGAAGCTCGCTTAC-3'；5'-TCTCTTTGCTCATGCGATCAG-3。(2)根据叶绿体基因组内参核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基(Rabcl)基因设计一对引物：5'-ATTACTTGAATGCGACTGCG-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种K型小麦胞质雄性不育细胞质的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)提取K型小麦细胞质雄性不育系叶片基因组DNA；(2)以叶片基因组DNA为模板，利用AFLP标记引物，对小麦不同细胞质雄性不育系进行扩增，获得K型小麦雄性不育细胞质的特异条带用于K型小麦胞质雄性不育细胞质的鉴定；所述AFLP标记引物为：E‑AGG：5'‑GACTGCGTACCAATTCAGG‑3'；M‑CTA：5'‑GATGAGTCCTGAGTAACTA‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种K型小麦胞质雄性不育细胞质的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)提取K型小麦细胞质雄性不育系叶片基因组DNA；(2)以叶片基因组DNA为模板，利用AFLP标记引物，对小麦不同细胞质雄性不育系进行扩增，获得K型小麦雄性不育细胞质的特异条带用于K型小麦胞质雄性不育细胞质的鉴定；所述AFLP标记引物为：E-AGG：5'-GACTGCGTACCAATTCAGG-3'；M-CTA：5'-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3'。2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤，将步骤(1)得到的叶片基因组DNA利用内参标记引物进行叶片基因组DNA扩增，检测叶片基因组DNA质量。3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤，将步骤(2)的特异条带...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛娜，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61