一种环境检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及环境检测领域，尤其涉及一种利用环境检测试剂盒及其用途。本发明专利技术提供的试剂盒包括：环介导恒温扩增引物，反应体系的说明，环境检测试剂盒组份配伍，微生物检测结果的读取。本发明专利技术提供的试剂盒可以实现对土传病原微生物的高效、快速、定性检测，无需PCR扩增即可通过肉眼判断靶标微生物的存在。本发明专利技术适用于环境检测、食品检测、病原菌检测等领域。

【技术实现步骤摘要】
一种环境检测试剂盒
本专利技术涉及环境检测领域，更具体地涉及土壤微生物检测领域，特别地涉及一种快速检测土壤中病原微生物的环境检测试剂盒。
技术介绍
土壤中存在数量巨大、种类繁多的微生物，它们中的绝大部分是有益的，在土壤发育、物质转化、结构形成、提高作物养分有效性、抑制病原菌活性等方面发挥着不可替代的作用，但是土壤中也存在着另一类引起作物病害的有害微生物，通称为土传病原微生物(soil-bornepathogens)。由生活在土壤中或残留在土壤的病株残体中的病菌引起的作物病害统称为土传病(soil-bornediseases)。日前，在节能温室中栽培的瓜类、茄果类、豆类等蔬菜上已经发现的病害有100多种，经常发生、危害比较严重的有50余种，在这些病害当中，除黄瓜霜霉病等极少数病害是借助气流和人们的农事活动从温室外面传入外，而绝大多数真菌性、细菌性病害和部分病毒性病害，其病菌都是在土壤中或借助病残体在土壤中越冬。这些病害的初次侵染，几乎都是来自温室内的土壤。防治土传病害，必须严格执行“以防为主、综合防治”的植保方针，以减少温室土壤菌源为首要目的，所以土传病原菌的快速检测及鉴定对于防治土传病害有至关重要的作用。本专利技术提供一种环境检测试剂盒，具有特异性强、灵敏度高、恒温、操作简单和检测结果快速读取等优点。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种环境检测试剂盒，所述环境检测试剂盒利用环介导等温扩增定性检测靶标微生物的存在。进一步地，所述靶标微生物为土传病原微生物，所述土传病原微生物包括但不限于病毒和细菌，所述病毒为大麦黄花叶病毒，所述细菌包括但不限于立枯丝核菌、镰刀菌、腐霉菌和黄萎轮枝孢菌。更进一步地，所述试剂盒包括如下成分：1.5ml反应管50支，50μL10Xbuffer，20μLMgSO4，20μL甜菜碱，20μLdATPs，20μLdCTPs，20μLdGTPs，20μLdUTPs，靶标基因引物序列各50μL，10μL尿嘧啶N糖基化酶，10μLBstDNA聚合酶，5mlPicoGreen，10ml双蒸水5管，所述环境检测试剂盒配套反应体系如下：双蒸水补足至20μL，55℃反应3分钟，95℃下5分钟，冷却至25℃，在产物中加入PicoGreen(Invitrogen,Carlsbad,USA)，通过颜色区别判断产物量，阳性产物颜色由橙色变为黄色，阴性产物则保持黄色不变。颜色变化的强烈程度与产物量相关，高产物量的样品颜色变化较早。优选地，所述试剂盒配套反应体系为：双蒸水补足至50μL，45℃反应4分钟，95℃下3分钟，冷却至25℃，在产物中加入PicoGreen，通过颜色区别判断产物量，阳性产物颜色由橙色变为黄色，阴性产物则保持黄色不变；颜色变化的强烈程度与产物量相关，高产物量的样品颜色变化较早。进一步地，所述环境检测试剂盒的检测方法为：步骤1、提取获得环境中土壤微生物总DNA序列；步骤2、按所述配套反应体系扩增土壤微生物总DNA样品；步骤3、于55℃反应3分钟，之后于95℃反应5分钟，冷却至25℃，在产物中加入PicoGreen，通过颜色区别判断产物量，阳性产物颜色由橙色变为黄色，阴性产物则保持黄色不变；步骤4、所述环境检测试剂盒能够用于检测大麦黄花叶病毒、立枯丝核菌、镰刀菌、腐霉菌以及黄萎轮枝孢菌。优选地，所述产物量能够通过肉眼观测浑浊度判定，如存在阳性产物则反应液呈现浑浊状态，如不存在阳性产物则反应液澄清。本专利技术属于“环介导的等温扩增”、“环介导的恒温扩增”“Loop-mediatedIsothermalAmplification”或LAMP技术是一种可替代PCR的廉价、快速、简便、准确的核酸检测技术，其特点是对靶基因的特定部位设定4条引物，利用链置换反应在恒温条件下使靶标基因高效扩增，其难点在于引物设计及反应体系的建立。LAMP技术与PCR技术有着相同的灵敏度，但其技术平台却比PCR更优越。由于其反应是多种引物共同启动，提高了反应结果的特异性；由于实行的是等温扩增，使得反应在恒温水浴箱中便可完成，不仅节约了仪器成本，而且使核酸检测操作方法更简便，适用于工业应用、临床诊断和高通量检测。相对于PCR反应的“变性—退火—延伸”温度循环，本专利技术的LAMP检测在整个扩增检测过程中保持阶段性恒温，减少了温度多次变化引起的非特异性扩增几率；同时由于扩增过程为阶段性恒温，不需要热循环仪，降低了检测成本。更为重要的是，LAMP扩增反应体系要求F3、B3、FIP和BIP4条引物完全匹配才能进行扩增，因此反应体系中的其它外源污染核酸或引物对反应的干扰很小。通过设计与2条引物哑铃状结构5’末端的单链茎环区域互补的环引物，可提高LAMP方法中DNA合成的开始位点的数量，使得LAMP反应可在60分钟内完成，从而提高了反应的速度。本专利技术的有益效果是：1、简易的反应体系：在恒温条件下实现了等温扩增环节与定量检测环节的交互进行，在核酸等温扩增的同时，实现了荧光信号的积累，整个反应在一个体系中完成；2、等温高效的扩增体系：本专利技术是基于具有链置换活性的BstDNA聚合酶进行的等温扩增技术，在提供相应的反应成分的条件下，实现了待检靶基因的指数增加。在提高扩增效率的同时降低了检测仪器的成本，而且减少了反应中不必要的非特异性扩增产物污染；3、检测速度快；设计与引物哑铃结构区域互补的滚环引物，可大大提高反应的速度；4、检测灵敏度高：可在0.5-1小时的时间内实现对样本的100-110倍的扩增，最小可对10ng的核酸分子进行定量检测，提高了检测的灵敏度；5、检测成本低：相对于核酸定量检测技术，本专利技术不需要特定的反应和检测仪器，只要普通的恒温水浴箱即可进行，便于工业应用和推广。附图说明图1LAMP扩增示意图；图2为土传病毒及病原菌LAMP检测结果。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步地详细描述。实施例1：LAMP引物设计本专利技术靶标病毒及病原菌为：大麦黄花叶病毒(Barleyyellowmosaicvirus，以下简称BYMV)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani以下简称Rhi)、镰刀菌(Fusariumspp以下简称Fus)、腐霉菌(Pythiumspp以下简称Pyt)、黄萎轮枝孢(Verticilliumalboatum以下简称Ver)。用BLAST软件选取上述病毒或病原菌的模式菌株的全长序列，选取BYMV、Rhi、Fus、Pyt、Ver病原菌的保守区域为靶标区域设计引物。使用DNAstar软件排列靶标区域的序列信息。将保守序列进一步用PrimerExploerV4软件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)分析，针对每种病原菌设计5套引物，经过扩增检测后，筛选得到一套高效LAMP引物。扩增原理如图1所示，引物信息如下：大麦黄花叶病毒BYMV：BYMV-BIP：5-GATTGTCCGTGGCTCTGGCTC-GTCTCAAGGGGCGAATC-3BYMV-FIP：5-TCCGATACGAGGTGCGGC-GTTTCCCAGAAGGGCTACC-3BYMV-B3：5-GGCTTTGTCAGGCGATCGTAGC-3B本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环境检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒利用环介导等温扩增定性检测靶标微生物的存在。

【技术特征摘要】
1.一种环境检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒利用环介导等温扩增定性检测靶标微生物的存在。2.根据权利要求1所述的环境检测试剂盒，其特征在于，所述靶标微生物为土传病原微生物，所述土传病原微生物包括但不限于病毒和细菌，所述病毒为大麦黄花叶病毒，所述细菌包括但不限于立枯丝核菌、镰刀菌、腐霉菌和黄萎轮枝孢菌。3.根据权利要求1或2所述的任一环境检测试剂盒，其特征在于，包括：1.5ml反应管50支，50μL10Xbuffer，20μLMgSO4，20μL甜菜碱，20μLdATPs，20μLdCTPs，20μLdGTPs，20μLdUTPs，靶标基因引物序列各50μL，10μL尿嘧啶N糖基化酶，10μLBstDNA聚合酶，5mlPicoGreen，10ml双蒸水5管，所述环境检测试剂盒配套反应体系如下：双蒸水补足至20μL，55℃反应3分钟，95℃下5分钟，冷却至25℃，在产物中加入PicoGreen(Invitrogen,Carlsbad,USA)，通过颜色区别判断产物量，阳性产物颜色由橙色变为黄色，阴性产物则保持黄色不变。颜色变化的强烈程度与产物量相关，...

【专利技术属性】
技术研发人员：范瑶飞，
申请(专利权)人：范瑶飞，
类型：发明
国别省市：浙江,33