本发明专利技术涉及一种编码玉米mTERF蛋白的基因ZmSmk3和所述基因ZmSmk3的克隆方法，包括以下步骤：分别提取若干纯合突变体和纯合野生型植株叶片的DNA；将提取的纯合突变体DNA混合构建纯合突变体DNA池；将提取的野生型DNA混合构建野生型DNA池；分别对构建的纯合突变DNA池和野生型DNA池进行热不对称交错PCR，获得PCR产物片段；用琼脂糖凝胶电泳检测获得的PCR扩增产物片段，回收纯合突变体DNA池中均出现的特异条带，进行测序获得突变基因ZmSmk3的序列。所述基因ZmSmk3编码mTERF蛋白，该基因的突变影响籽粒发育进程，以及对育种实践具有重要的指导意义。
【技术实现步骤摘要】
一种编码玉米mTERF蛋白的基因ZmSmk3及其克隆方法和应用
本专利技术涉及植物基因工程
，尤其涉及一种编码玉米mTERF蛋白的基因ZmSmk3及其克隆方法和应用。
技术介绍
线粒体是重要的能量转换站，能够高效地将有机物中储存的能量转换为细胞生命活动的直接能源ATP(三磷酸腺苷)，为生命活动提供能量来源(MackenzieandMcIntosh,1999；Gualbertoetal.,2014)。它具有自主的DNA复制、转录和蛋白质合成系统，是半自主细胞器。其中，大多数的线粒体蛋白由核编码，受到细胞核的调控。线粒体基因的表达是一个复杂的生物学过程，包括RNA(核糖核酸)的转录、RNA编辑、内含子剪切、RNA的翻译、成熟及降解(HammaniandGiegé,2014)。线粒体的基因组中包含20-23个第二类内含子，只有在某些物种中线粒体cox1的内含子为第一类内含子(Bonen,2008)。大多数的线粒体基因内含子能够被顺式剪切，而某些内含子因为缺乏剪切特异的元件，只能够被反式剪切(Bonen,2008)。在细菌和酵母线粒体中，第二类内含子的剪切是由成熟酶(MATs,maturases)的加工完成的(Singhetal.,2002)。MATs基因位于内含子中并直接被编码，从而特异的剪切该宿主内含子。仅有一个成熟酶(MatR)基因位于nad1的第四个内含子中，但是它对线粒体内含子的剪切功能还不明确。除了MatR，还有几个核编码的成熟酶参与第二类内含子的剪切。在拟南芥中，有4个核编码的成熟酶基因(nMAT1–4)参与线粒体内含子的剪切(MohrandLambowitz,2003；Kerenetal.,2009；Kerenetal.,2012；Cohenetal.,2014)。除了成熟酶，为了精确调控这一复杂的生物学过程，核基因组进化出一些特异的靶向细胞器的蛋白质家族。参与高等植物细胞器第二类内含子剪切的蛋白家族还包括：PPR(pentatricopeptiderepeat)蛋白家族(BarkanandSmall,2014))，染色质固缩调节因子(REGULATOROFCHROMOSOMECONDENSATION，RCC)家族(Kühnetal.,2011)，植物细胞器RNA识别(plantorganellarRNArecognition，PORR)蛋白家族(Kroegeretal.,2009；ColasdesFrancs-Smalletal.,2012)，叶绿体RNA剪接及核糖体成熟(chloroplastRNAsplicingandribosomematuration，CRM)蛋白家族(Zmudjaketal.,2013)及线粒体转录终止因子(mitochondrialtranscriptionterminationfactor，mTERF)家族(HammaniandBarkan,2014)。虽然这些蛋白家族的起源和结构都各不相同，但是它们共有的特点是具有RNA结合结构域(Xiuetal.,2016)。mTERF最早作为人类mtDNA结合蛋白和线粒体转录终止因子被鉴定(Kruseetal.,1989)，mTERF蛋白质由重复多个的mTERF基序(mTERFmotif)组成，其中每个基序含有约30个氨基酸。保守的mTERF基序的第8个氨基酸残基为脯氨酸，11、18和25位点形成3个X3LX3的亮氨酸拉链(leucinezipper)(Robertietal.,2009)。植物mTERF通常靶向线粒体或叶绿体，调控细胞器的基因表达(Roblesetal.,2012)。植物中被研究报道的mTERF基因，大多集中在拟南芥中，迄今为止，大部分mTERF蛋白的功能尚未解析。因此，解析mTERF蛋白的功能及生物学作用机理具有重要作用。尤其对于籽粒发育进程中的mTERF蛋白功能的解析，明确其对籽粒生长发育的影响和作用机理对育种实践将具有重要的指导意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种编码玉米mTERF蛋白的基因ZmSmk3及其克隆方法和应用。本专利技术提供了一种编码玉米mTERF蛋白的基因ZmSmk3，所述基因ZmSmk3的序列如SeqIDNo.1所示。本专利技术还提供了所述的基因ZmSmk3的克隆方法，包括以下步骤：1)分别提取若干纯合突变体和纯合野生型玉米植株叶片的DNA；2)将提取的纯合突变体DNA混合构建多个纯合突变体DNA池；将提取的野生型DNA混合构建野生型DNA池；3)分别对步骤2)中构建的纯合突变体DNA池和野生型DNA池进行热不对称交错PCR，获得突变体和野生型的PCR扩增产物片段；4)用琼脂糖凝胶电泳检测步骤3)获得的PCR扩增产物片段，回收纯合突变体DNA池中均出现的，野生型DNA池未出现的特异条带，进行测序获得突变基因ZmSmk3的序列。优选的，步骤2)中所述纯合突变体DNA池为3个；野生型DNA池为1个。优选的，步骤3)中所述的热不对称交错PCR包括第一轮PCR和第二轮PCR；所述第一轮PCR的模板为3个纯合突变体DNA池和1个野生型DNA池，所述第一轮PCR的引物包括第一轮特异扩增引物TIR9-1和随机引物，所述引物TIR9-1的序列如SeqIDNo.3所示。优选的，所述第二轮PCR的模板为第一轮PCR获得的产物；所述第二轮PCR的引物包括第二轮特异扩增引物TIR9-2和随机引物，所述引物TIR9-2的序列如SeqIDNo.4所示。优选的，所述随机引物的序列如SeqIDNo.5～16所示。本专利技术提供了所述的突变基因ZmSmk3的检测方法，包括以下步骤：a)将突变体混池特异的条带进行测序，测序结果与玉米基因组序列比对，获得突变基因ZmSmk3在玉米基因组上的匹配位置；b)以匹配位置的插入位点为中心设计引物S21F和S21R；c)以S21F+S21R，S21F+TIR6，S21R+TIR6三对引物对玉米单株的DNA进行扩增获得扩增条带，若扩增条带只有S21F+S21R相应的PCR产物条带，则该玉米单株对应的基因型为野生型，基因ZmSmk3未发生突变；若扩增条带包括三对引物扩增相应的PCR产物条带，则该玉米单株为杂合基因型，存在杂合突变基因ZmSmk3；若扩增条带包括S21F+TIR6，S21R+TIR6两对引物相应的PCR产物条带，则该玉米单株为纯合突变型，存在纯合突变基因ZmSmk3。优选的，所述S21F的序列如SeqIDNo.17所示；所述S21R的序列如SeqIDNo.18所示。优选的，所述TIR6的序列如SeqIDNo.19所示。本专利技术提供了所述突变基因ZmSmk3在玉米育种中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术首次克隆了一个编码玉米mTERF蛋白的基因ZmSmk3，所述基因ZmSmk3的突变使得线粒体nad4及nad1两个基因内含子不能正常剪切，影响线粒体复合体Ⅰ组装效率和活性，从而影响玉米籽粒发育。对于籽粒发育进程中的mTERF蛋白功能的解析，明确其对籽粒生长发育的影响和作用机理以及对育种实践具有重要的指导意义。附图说明图1为突变基因ZmSmk3导致突变籽粒的表型观察；图2为石蜡切片观察野生籽粒和突变籽粒发育形态结构对比图；图3为ZmSmk3的基因结构示意图；图4为实施例2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码玉米mTERF蛋白的基因ZmSmk3，其特征在于，所述基因ZmSmk3的序列如Seq ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种编码玉米mTERF蛋白的基因ZmSmk3，其特征在于，所述基因ZmSmk3的序列如SeqIDNo.1所示。2.权利要求1所述的基因ZmSmk3的克隆方法，包括以下步骤：1)分别提取若干ZmSmk3纯合突变体和纯合野生型玉米植株叶片的DNA；2)将提取的纯合突变体DNA混合构建多个纯合突变体DNA池；将提取的野生型DNA混合构建野生型DNA池；3)对步骤2)中构建的纯合突变体DNA池和野生型DNA池进行热不对称交错PCR，获得突变体和野生型的PCR扩增产物片段；4)用琼脂糖凝胶电泳检测步骤3)获得的PCR扩增产物片段，回收纯合突变体DNA池中均出现的，野生型DNA池未出现的特异条带，进行测序获得突变基因ZmSmk3的序列。3.根据权利要求2所述的克隆方法，其特征在于，步骤2)中所述纯合突变体DNA池为3个；野生型DNA池为1个。4.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步骤3)中所述的热不对称交错PCR包括第一轮PCR和第二轮PCR；所述第一轮PCR的模板为3个纯合突变体DNA池和1个野生型DNA池，所述第一轮PCR的引物包括第一轮特异扩增引物TIR9-1和随机引物，所述引物TIR9-1的序列如SeqIDNo.3所示。5.根据权利要求4所述的克隆方法，其特征在于，所述第二轮PCR的模板为第一轮PCR获得的产物...
【专利技术属性】
技术研发人员：邱法展，任雪梅，潘振远，谭增栋，秦瑶，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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