对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质和使用它的亲和分离剂、液相色谱柱制造技术

本发明专利技术的课题在于提供对丝氨酸蛋白酶或者嗜热菌蛋白酶具有耐性且具有免疫球蛋白结合活性、可适合作为亲和配体使用的蛋白质。本发明专利技术的一个实施方式是具有2个以上的来源于蛋白A的E、D和A结构域的氨基酸序列中的任一个的结构域、在该结构域的至少一个氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸且C末端的赖氨酸缺失或者被替换的、对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质；或者具有2个以上的来源于蛋白A的B、C和Z结构域中的任一个的结构域、在该结构域的至少一个氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸且第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸缺失或者被替换的、对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质。

An affinity protein for immunoglobulin and an affinity separation agent used for it and a liquid chromatography column

The subject of the invention is to provide proteins that are resistant to serine proteases or thermophilic proteases, and have immunoglobulin binding activity, which are suitable for use as affinity ligands. One embodiment of the present invention is more than 2 from the protein A E, D and A domains in the amino acid sequence of the a domain, in the domain of at least one amino acid sequence contains more than 1 lysine and C terminal lysine deficiency or being replaced, the immunoglobulin binding protein; lysine deletion of B, C and Z domains or sources with more than 2 protein in the A domain, either in the domain of at least one amino acid sequence contains more than 1 lysine and fourth lysine and C end or replaced, the immunoglobulin binding protein.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质和使用它的亲和分离剂、液相色谱柱
本专利技术涉及与免疫球蛋白特异性结合的蛋白质和以该蛋白质为免疫球蛋白结合性亲和配体的亲和分离剂、以及液相色谱柱。
技术介绍
抗体具有与被称为抗原的物质特异性结合的功能和与其它的生物体分子、细胞协同地将具有抗原性的因子去毒·除去的功能。抗体这个名称是强调这种与抗原结合的功能的名字，作为物质，被称为“免疫球蛋白”。近年来，随着基因工程、蛋白质工程和细胞工程的发展，被称为抗体药物的利用抗体所具有的功能的医药品的开发盛行。由于与现有的药物相比，抗体药物更加特异性地作用于靶分子，所以预期副作用更少，且得到好的治疗效果，实际上有助于各种病症的改善。另一方面，由于抗体药物被大量给予生物体，所以与其它的重组蛋白质药品相比时，可以说其纯度对品质的影响大。因此，为了制造纯度高的抗体，一般采用利用吸附材料的亲和色谱等方法，该吸附材料以与抗体特异性结合的分子为配体。作为抗体药物开发的基本上是单克隆IgG抗体，采用重组培养细胞技术等大量生产，利用对IgG抗体具有亲和性的蛋白质进行纯化。作为对IgG抗体具有亲和性的免疫球蛋白结合性蛋白质，熟知有蛋白A。蛋白A是由革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)生产的细胞壁蛋白质的1种，由信号序列S、5个免疫球蛋白结合性结构域(E结构域、D结构域、A结构域、B结构域、C结构域)和细胞壁结合结构域即XM区域构成(非专利文献1)。在抗体药物制造工序的初始纯化工序(捕获工序)中，一般利用将蛋白A作为配体固定于水不溶性担载体而得的亲和色谱柱。为了改进该亲和色谱柱的性能，近年来，进行了与作为配体的蛋白A有关的各种开发，尝试了使用蛋白质工程性地加入了改变的重组蛋白A。例如，作为重组蛋白A，已知有除去了无免疫球蛋白结合活性的XM区域的蛋白A(rProteinASepharose(注册商标)、GEHealthCareJapan公司制)、专利文献1公开的具有向B结构域导入了变异而得的修饰结构域即Z结构域的蛋白A等。Z结构域是对B结构域导入了将第29位的甘氨酸替换成丙氨酸的变异而得的修饰结构域，与B结构域相比耐碱性高。如此，为了提高配体功能，开发了耐碱性提高的重组蛋白A、能够使抗体在弱酸性时溶出的重组蛋白A。在专利文献2中，为了提高耐碱性，公开了包含蛋白A的C、B、Z结构域的N末端3～5个连续的氨基酸缺失的亲和色谱配体。在专利文献3中，为了提高碱稳定性，公开了具有蛋白A的结构域C单元的3位～6位的Asn-Lys-Phe-Asn缺失的序列的亲和色谱配体。在专利文献4中，为了提高耐碱性，公开了将蛋白A的B、Z结构域的3位和6位的天冬酰胺替换成其它的氨基酸的免疫球蛋白结合蛋白质。在专利文献5中，为了能以弱酸性使抗体脱离，公开了在蛋白A的E、D、A、B、C结构域中不含赖氨酸和半胱氨酸残基的序列的抗体识别结合蛋白质。现有技术文献专利文献专利文献1：美国专利第5143844号说明书专利文献2：日本特开2012-254981号公报专利文献3：日本特表2010-504754号公报专利文献4：日本特表2005-538693号公报专利文献5：日本特开2013-256484号公报非专利文献非专利文献1：HoberS.et.al，J.Chromatogr.B.，2007，Vol.848，p.40-47
技术实现思路
经过本专利技术人等的研究，首次发现了如下问题：由于制造重组蛋白A时使用的宿主微生物所产生的蛋白酶或将由重组培养细胞生产的IgG抗体纯化时的培养细胞所产生的蛋白酶的作用，作为配体的蛋白A被切断，免疫球蛋白结合活性大幅降低。明确了特别是在从培养液纯化重组蛋白A的工序中提高pH使其吸附或流经离子交换树脂的时刻，另外在纯化前或纯化后进行浓缩、脱盐等工序的时刻，以及利用固定了重组蛋白A的分离剂进行从含有免疫球蛋白的培养液纯化免疫球蛋白的工序的时刻，蛋白酶所致的切断成为显著的问题。作为上述蛋白酶之一，有丝氨酸蛋白酶。专利文献1～4所公开的重组蛋白A没有丝氨酸蛋白酶耐性，作为亲和色谱柱的配体使用存在问题。另外，根据本专利技术人等的研究，新发现了专利文献5中公开的不含赖氨酸和半胱氨酸的重组蛋白A存在如下问题：免疫球蛋白结合活性不充分，特别是多聚体化时与野生型相比免疫球蛋白结合活性低，终究无法充分发挥作为亲和色谱柱的配体的功能。另外，作为产生上述问题的其它的蛋白酶，有嗜热菌蛋白酶。嗜热菌蛋白酶是来源于芽孢杆菌属细菌的金属蛋白酶，在温度高的环境、pH高的环境下活性高。由于专利文献1、3～5中公开的重组蛋白A没有嗜热菌蛋白酶耐性，所以无法以完好的形态回收蛋白质，作为亲和色谱柱的配体使用存在问题。另外，根据本专利技术人等的研究，新发现了专利文献2中公开的重组蛋白A虽包含具有嗜热菌蛋白酶耐性的蛋白，但存在免疫球蛋白结合活性降低，终究无法充分发挥作为亲和色谱柱的配体的功能这样的课题。因此，本专利技术的课题在于提供对蛋白酶具有耐性且具有充分的免疫球蛋白结合活性、可适合作为亲和配体使用的蛋白质。特别地，本专利技术的第1课题在于提供对蛋白酶中特别是丝氨酸蛋白酶具有耐性且具有充分的免疫球蛋白结合活性、可适合作为亲和配体使用的蛋白质。另外，本专利技术的第2课题在于提供对蛋白酶中特别是嗜热菌蛋白酶具有耐性且具有充分的免疫球蛋白结合活性、可适合作为亲和配体使用的蛋白质。本专利技术人等为了解决上述第1课题进行了深入研究，结果发现在蛋白A的特定结构域的氨基酸序列中，连接结构域与结构域的区域不含赖氨酸时丝氨酸蛋白酶耐性提高，从而完成了本专利技术。另外，本专利技术人等为了解决上述第2课题进行了深入研究，结果发现在蛋白A的特定结构域的氨基酸序列中，连接结构域与结构域的区域不含疏水性氨基酸时嗜热菌蛋白酶耐性提高，从而完成了本专利技术。即，上述课题通过以下的构成来实现。[1]一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其特征在于，具有2个以上来源于序列号1～3记载的蛋白A的E、D和A结构域中任一个的结构域，在该结构域的至少一个氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸且C末端的赖氨酸缺失或者被替换。[2]-(1)一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其特征在于，具有2个以上来源于序列号4～6记载的蛋白A的B、C和Z结构域中任一个的结构域，在该结构域的至少一个氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸且第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸缺失或者被替换。[2]-(2)一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其特征在于，具有2个以上来源于序列号4～6记载的蛋白A的B、C和Z结构域中任一个的结构域，在该结构域的至少一个氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸，将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位～第5位的序列作为连接位置序列(第1连接元件)时，至少一个该连接位置序列(第1连接元件)的C末端的赖氨酸和第4位的赖氨酸缺失或者被替换。[3]根据[1]或[2]所述的蛋白质，其中，在上述缺失或者被替换的第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸中，该第4位的赖氨酸和/或该C末端的赖氨酸缺失。[4]根据[1]～[3]中任一项所述的蛋白质，其中，将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位～第5位的序列作为连接位置序列(第1连接元件)时，至少一个该连接位置序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其特征在于，具有2个以上来源于序列号1～3记载的蛋白A的E、D和A结构域中任一个的结构域，在该结构域的至少一个结构域的氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸且C末端的赖氨酸缺失或者被替换。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.05 JP 2015-021577;2015.02.05 JP 2015-021571.一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其特征在于，具有2个以上来源于序列号1～3记载的蛋白A的E、D和A结构域中任一个的结构域，在该结构域的至少一个结构域的氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸且C末端的赖氨酸缺失或者被替换。2.一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其特征在于，具有2个以上来源于序列号4～6记载的蛋白A的B、C和Z结构域中任一个的结构域，在该结构域的至少一个结构域的氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸且第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸缺失或者被替换。3.一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其特征在于，具有2个以上来源于序列号4～6记载的蛋白A的B、C和Z结构域中任一个的结构域，在该结构域的至少一个结构域的氨基酸序列中包含1个以上的赖氨酸，将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位～第5位的序列作为连接位置序列时，至少一个该连接位置序列的C末端的赖氨酸和第4位的赖氨酸缺失或者被替换。4.根据权利要求1～3中任1项所述的蛋白质，其中，在所述缺失或者被替换的第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸中，该第4位的赖氨酸和/或该C末端的赖氨酸缺失。5.根据权利要求1～4中任1项所述的蛋白质，其中，将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位～第5位的序列作为连接位置序列时，至少一个该连接位置序列由1个以上的氨基酸构成。6.根据权利要求1～5中任1项所述的蛋白质，其中，在所述缺失或者被替换的第4位的赖氨酸和C末端的赖氨酸中，用亲水性氨基酸替换该第4位的赖氨酸和/或该C末端的赖氨酸。7.根据权利要求1～6中任1项所述的蛋白质，其中，将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位～第5位的序列作为连接位置序列时，在全部的连接位置序列中，赖氨酸缺失或者被替换。8.根据权利要求1～7中任1项所述的蛋白质，其中，将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位～第5位的序列作为连接位置序列时，至少一个该连接位置序列不含赖氨酸。9.根据权利要求1～8中任1项所述的蛋白质，其中，将各结构域的C末端的赖氨酸和各结构域的氨基酸序列中的第1位～第5位的序列作为连接位置序列时，至少一个该连接位置序列不含精氨酸。10.一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其特征在于，具有2个以上来源于序列号3～6记载的蛋白A的A、B、C和Z结构域中任一个的结构域...

【专利技术属性】
技术研发人员：与田祥也，三沢悟，中田理纱，
申请(专利权)人：三菱化学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP