一种重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白及应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白及应用。所述的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码上述重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的基因，其核苷酸序列SEQ ID NO.2所示：本发明专利技术将上述优化后的金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的基因的核苷酸序列重组于大肠杆菌表达系统中，通过诱导表达和纯化，得到的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素融合蛋白表达水平高，产量高。此外，与现有技术相比，本发明专利技术通过控制低温超声条件、选择两次镍琼脂糖亲和层析以及Triton X‑114试剂的添加严格控制去内毒素，为后续蛋白的应用安全提供保障。

A B type recombinant staphylococcal enterotoxin protein and its application

The invention belongs to the field of gene engineering technology, in particular relates to a recombinant staphylococcal enterotoxin B protein and its application. B type recombinant Staphylococcus aureus enterotoxin the protein, the amino acid sequence of SEQ ID NO.1, encoding the recombinant B protein of Staphylococcus aureus enterotoxin genes, the nucleotide sequence of SEQ ID NO.2 shows: the nucleotide sequence of the recombinant Staphylococcus aureus enterotoxin B the optimized protein gene in Escherichia coli expression system, purified by inducing the expression of B and recombinant staphylococcal enterotoxin fused protein expression level is high, high yield. In addition, compared with the prior art, the invention is controlled by low temperature ultrasonic conditions, choose to add two times to strictly control the endotoxin Ni agarose affinity chromatography and Triton X 114 reagents, to provide protection for the safe application of subsequent protein.

【技术实现步骤摘要】
一种重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白及应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白及应用。
技术介绍
葡萄球菌属(Staphylococcus)中的金黄色葡萄球菌(S.aureus)致病力最强，常引起食物中毒。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，直径为0.8～1.0μm，呈葡萄状。无芽抱、无鞭毛。需氧和兼性厌氧菌，生长温度在6.5～46℃之间，最适温度为30～37℃。可在pH4.0～9.8范围内生长，最适生长pH7.4。能在15％NaCl和40％胆汁中生长。在普通肉汤固体培养基上能形成光滑、低凸、闪光、边缘整齐的菌落，菌落色素不稳定，但多数为金黄色。该菌在20～37℃条件下，能产生引起食物中毒的肠毒素。其中，金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)是由金黄色葡萄球菌分泌的一种细菌性超抗原，具有多种生物学活性。超抗原活化T细胞的方式与通常抗原不同，它可不经过抗原提呈细胞(APC)的内化、降解过程，直接与MHCⅡ类分子及TCR-β链的V区结合，选择性地大量扩增和激活T细胞，故表达MHCⅡ类分子的细胞都能与之结合，激活的T细胞能对表达MHCⅡ类分子的靶细胞产生细胞毒作用，这种作用被称为超抗原依赖的细胞介导的细胞毒作用(superantigen-dependentcellmediatedcytotoxicity，SDCC)。与此同时还能诱导肿瘤敏感性细胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-2的产生，从而达到间接杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤生长的作用。与普通抗原相比，超抗原SEB不需APC的处理，亦不受MHCⅡ类分子的限制，又由于Vβ基因的多态性，针对某一特定的超抗原，在T细胞库中约有5％～20％细胞可发生反应。基于此，超抗原SEB目前被越来越多地应用于肿瘤治疗方面，成为免疫学研究的一个重要方向。最早获得的葡萄球菌肠毒素超抗原是从金黄色葡萄球菌的发酵液中提取的。但天然毒素的产量低，其研究和应用方面受到了限制。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足与缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白。本专利技术的另一目的在于提供一种重组质粒pET32a-SEB。本专利技术的第三个目的在于提供一种表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株。本专利技术的第四个目的在于提供上述重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的制备方法。本专利技术的第五个目的在于提供上述重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白，其氨基酸序列如下所示：ENLYFQGESQPDPKPDELHKSSKFTGLMENMKVLYDDNHVSAINVKSIDQFLYFDLIYSIKDTKLGNYDNVRVEFKNKDLADKYKDKYVDVFGANYYYQCYFSKKTNDINSHQTDKRKTCMYGGVTEHNGNQLDKYRSITVRVFEDGKNLLSFDVQTNKKKVTAQELDYLTRHYLVKNKKLYEFNNSPYETGYIKFIENENSFWYDMMPAPGDKFDQSKYLMMYNDNKMVDSKDVKIEVYLTTKKK一种编码上述重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的基因，其核苷酸序列如下所示：GAGAACCTGTACTTCCAGGGCGAAAGCCAGCCGGACCCGAAACCGGATGAACTGCACAAAAGCAGCAAATTCACCGGCCTGATGGAAAACATGAAAGTGCTGTACGACGACAACCACGTCTCCGCCATCAACGTGAAAAGCATCGATCAGTTCCTGTACTTCGACCTGATCTACTCCATCAAAGACACCAAACTGGGTAACTACGACAACGTCCGCGTCGAGTTCAAAAACAAAGACCTGGCGGACAAGTACAAAGACAAATACGTGGACGTTTTCGGCGCGAACTACTACTACCAGTGCTACTTCTCCAAAAAGACCAACGACATCAACTCCCACCAGACCGATAAACGCAAGACCTGCATGTACGGCGGCGTGACCGAACACAACGGCAACCAGCTGGACAAATACCGCAGCATCACCGTGCGCGTGTTCGAGGACGGCAAAAACCTGCTGAGCTTCGATGTGCAGACCAACAAGAAAAAAGTGACCGCGCAGGAACTGGACTACCTGACCCGTCACTACCTGGTGAAAAACAAAAAACTGTACGAGTTCAACAACTCCCCGTACGAAACCGGCTACATCAAGTTCATCGAAAACGAAAACAGCTTCTGGTACGACATGATGCCGGCGCCGGGCGACAAGTTCGACCAGTCCAAGTACCTGATGATGTACAACGACAACAAAATGGTTGACAGCAAAGACGTGAAAATCGAAGTGTACCTGACCACCAAAAAGAAATAATGA一种重组质粒pET32a-SEB，是通过将上述编码重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的基因的核苷酸序列与载体pET-32a连接得到的；所述的重组载体pET32a-SEB的制备方法，包含如下步骤：(1)通过全基因合成，得到上述编码重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的基因；(2)使用引物X5523-1和引物X5523-34对步骤(1)得到的基因进行PCR扩增，得到目的片段并回收纯化；(3)将步骤(2)回收纯化后的目的产物与载体pET-32a进行连接，得到重组质粒ET32a-SEB；所述的引物X5523-1和引物X5523-34的核苷酸序列如下所示：引物X5523-1：GACACGGTACCGAGAACCTGTACTTCCAG；引物X5523-34：GTGTCCTCGAGTCATTATTTCTTTTTGGTGGTCAGG；一种表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株，是将上述重组质粒pET32a-SEB转入宿主细胞中得到的；所述的宿主细胞优选为大肠杆菌BL21(DE3)；所述的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的制备方法，包含如下步骤：将上述表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株作为表达菌株，基于大肠杆菌表达系统进行诱导表达；离心收集菌体，洗涤悬浮，然后超声破碎，离心，收集上清，纯化，得到重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白；所述的诱导表达的具体操作优选为：将上述表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株进行液体扩大培养至OD值达到0.5～0.6时，添加终浓度为0.5mM的IPTG，220rpm、37℃诱导4h；所述的液体扩大培养，包含如下步骤：挑取表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株的单菌落于含有终浓度为50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm过夜培养，得到种子液；将培养的种子液按1：100体积比接种于含有终浓度为50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养；所述的洗涤悬浮的试剂优选为破碎Buffer，所述的破碎Buffer为含0.1％w/vTritonX-114的1×PBS缓冲液，pH值为7.4；所述的超声破碎的条件优选为：冰浴下，超声功率为400～450本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种编码权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种重组质粒pET32a-SEB，其特征在于：是通过将权利要求2中所述的核苷酸序列与载体pET-32a连接得到的。4.权利要求3所述的重组载体pET32a-SEB的制备方法，其特征在于包含如下步骤：(1)通过全基因合成，得到上述编码重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的基因；(2)使用引物X5523-1和引物X5523-34对步骤(1)得到的基因进行PCR扩增，得到目的片段并回收纯化；(3)将步骤(2)回收纯化后的目的产物与载体pET-32a进行连接，得到重组质粒ET32a-SEB；所述的引物X5523-1和引物X5523-34的核苷酸序列如下所示：引物X5523-1：GACACGGTACCGAGAACCTGTACTTCCAG；引物X5523-34：GTGTCCTCGAGTCATTATTTCTTTTTGGTGGTCAGG。5.一种表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株，其特征在于：是将权利要求3所述的重组质粒pET32a-SEB转入宿主细胞中得到的。6.根据权利要求5所述的表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的菌株，其特征在于：所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。7.权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素蛋白的制备方法，其特征在于包含如下步骤：将权利要求5或6所述的表达重组金黄色葡萄球菌B型肠毒素...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾庆明，
申请(专利权)人：曾庆明，
类型：发明
国别省市：广东,44