一种定点突变的甘露聚糖酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种定点突变的甘露聚糖酶。它是由氨基酸序列为SEQ IDNO.1的来源于Armillariella tabescens的β‑甘露聚糖酶MAN47中制造多个氨基酸取代而产生的突变体，所述的氨基酸取代包括第197、280、380位的取代。本发明专利技术所述的β‑甘露聚糖酶MAN47突变体具有耐高温、较宽的pH稳定性、对胰蛋白酶耐受性提高的优点。

A site directed mutagenesis of manna polyase and its application

The present invention discloses a designated mutagenesis manna polyase. It is from the amino acid sequence from SEQ IDNO.1 to Armillariella tabescens beta mannase MAN47 manufacturing multiple amino acid substitutions and mutants, including the amino acid substitution at position 197th, 280th, 380th of the. The beta mannanase MAN47 mutant with high temperature resistance, wide pH stability, trypsin tolerance advantages.

【技术实现步骤摘要】
一种定点突变的甘露聚糖酶及其应用
本专利技术涉及一种定点突变的甘露聚糖酶，特别是涉及来源于Armillariellatabescens的β-甘露聚糖酶MAN47的突变体。
技术介绍
β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)是一类能水解甘露聚糖上β-1,4-糖苷键、促使其水解生成小的寡甘露糖的酶的总称。根据酶作用底物特异性和作用特点，β-甘露聚糖酶可以分为外切β-甘露聚糖酶和内切β-甘露聚糖酶两种类型。其中，内切β-甘露聚糖酶是降解β-甘露聚糖的主要酶，它主要水解甘露聚糖和异甘露聚糖(半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖)中的β-1,4-D-甘露糖苷键。β-甘露聚糖酶对底物有严格的键专一性。β-甘露聚糖酶广泛存在于自然界中，在动物(海洋动物)、发芽植物(如番茄、咖啡豆、瓜儿豆、魔芋、四棱豆等)的种子和微生物(包括细菌、真菌和放线菌)中都有所发现，其中微生物是β-甘露聚糖酶的主要来源。β-甘露聚糖酶在食品、医药、造纸、饲料和石油等工业中有广泛的应用。考虑到动物摄食、营养和饲料加工等过程的特殊要求，饲用甘露聚糖酶需具备一定的特殊性：如：良好温度稳定性，能够经受高温制粒的加工后在常温下仍具有高酶活；广谱的pH稳定性，一般动物的消化道不同位置酸碱环境不同，pH值在2.5-6.8左右，因此饲用甘露聚糖酶需要在酸性的环境下稳定存在的同时还需要在酸性和中性的条件下维持较高活性。由于甘露聚糖酶在农业、食品等领域的广泛应用需求，人们对甘露聚糖酶的研究日益活跃。目前主要集中在(1)甘露聚糖酶的制备生产方法，如专利：CN201110038699.7(一种利用天然枯草芽孢杆菌制备β-甘露聚糖酶的方法)、CN201210133095.5(一种快速生产高纯度低聚甘露聚糖的方法)、CN200610073160.4(β-甘露聚糖酶及其表达方法与专用工程菌)、CN200510103125.8(一种甘露聚糖酶及其编码基因与应用)、CN201010601999.7(一种生产β-甘露聚糖酶的菌株及生产工艺)；(2)筛选和克隆来自不同物种或者具有耐热或者耐酸的β-甘露聚糖酶，如专利：CN200810113343.3(一种嗜酸β-甘露聚糖酶MAN5A及其基因和应用)、CN200710121923.2(β-甘露聚糖酶及基因和制备方法以及载体和宿主细胞)、CN201010550927.4(一种新型β-甘露聚糖酶基因的克隆及重组酶的制备)、CN201110086452.2(耐热β-甘露聚糖酶及其编码基因、重组菌和应用)、CN201210121370.1(一种耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因及其应用)、CN201110410517.4(β-1,4-内切甘露聚糖酶TviMan5A基因的克隆及重组酶的制备)、CN201110330274.3(一种具有宽pH范围的β-甘露聚糖酶BA-Man5A及基因和应用)、CN201010621906.7(一种高温酸性甘露聚糖酶Man5C1及其基因和应用)、CN201310190483.1(高温β-甘露聚糖酶编码基因及基因工程菌和应用)、CN201310190147.7(一种β-甘露聚糖酶、编码基因及其生产菌和应用)、CN201110262497.0(一种pH2.5～6.5范围内有高活性的β-甘露聚糖酶MAN5A及基因和应用)、CN01410234352.3(一种高温酸性β-甘露聚糖酶Man5DW1基因和应用)、CN200510085377.2(一种β-甘露聚糖酶及其编码基因和应用)；(3)对碱性和中性β-甘露聚糖酶的基因克隆，如专利：CN201110058791.X(一种耐碱β-甘露聚糖酶Man5A及基因和应用)、CN201310062872.6(一种耐高温碱性甘露聚糖酶Man5X27及基因和应用)、CN201410234434.8(一种中性β-甘露聚糖酶Man26DW1及其基因和应用)。然而，目前饲料添加剂用酶生产后都需要经过高温制粒，添加剂的使用都是通过添加在饲料中一起喂食动物，经胃到达肠道，在肠道中发挥酶的作用。在这个过程中，饲用酶会受到动物肠道消化酶不同程度的破坏，而降低了使用效率，因此，发现和制造能够耐高温、耐酸、具有对消化酶(如对胰蛋白酶)耐受性提高的β-甘露聚糖酶，对于β-甘露聚糖酶用作饲用酶的应用十分有价值。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种定点突变的甘露聚糖酶，它具有耐高温、较宽的pH稳定性、对胰蛋白酶耐受性提高等优点。本专利技术是对来自假密环菌(Armillariellatabescens)的β-甘露聚糖酶MAN47的基因进行定点突变。由假密环菌(Armillariellatabescens)中获得的β-甘露聚糖酶MAN47，该酶的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.1。根据本专利技术所述的一种定点突变改造的β-甘露聚糖酶MAN47，是由氨基酸序列为SEQIDNO.1的来源于假密环菌(Armillariellatabescens)的β-甘露聚糖酶MAN47中制造多个氨基酸取代而产生的具有耐高温、较宽的pH稳定性、对胰蛋白酶耐受性提高的β-甘露聚糖酶MAN47突变体，所述的氨基酸取代是第197、280和380位的取代。根据本专利技术所述的定点突变改造的β-甘露聚糖酶MAN47的进一步特征，所述在第197位的氨基酸取代是用亮氨酸(Leucine,Leu,L)取代异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I)；第280位的氨基酸取代是用天冬酰胺(Asparagine,Asn,N)取代赖氨酸(Lysine,Lys,K)；第380位的氨基酸取代是用丙氨酸(Alanine,Ala,A)取代缬氨酸(Valine,Val,V)；所述的定点突变改造的β-甘露聚糖酶MAN47突变体的氨基酸序列为SEQIDNO.2。本专利技术所述的假密环菌(Armillariellatabescens)来源的β-甘露聚糖酶MAN47突变体(mMAN47)，具有耐高温、较宽的pH稳定性、对胰蛋白酶耐受性提高的特点。该突变体酶与野生型β-甘露聚糖酶MAN47相比在高温90℃和pH4.0的条件下，酶活力是野生型的8倍以上，在人工肠液(pH6.8胰蛋白酶浓度10mg/mL溶液)中，突变酶的胰蛋白酶抗性较野生型提高了60％，半衰期达到180分钟。进一步地，本专利技术提供了一种DNA分子，其编码本专利技术所述的具有耐高温、对胰蛋白酶耐受性提高的假密环菌(Armillariellatabescens)来源的β-甘露聚糖酶MAN47突变体。优选地，本专利技术所述的DNA分子的核苷酸序列为SEQIDNO.3。本专利技术的另一个目的是提供一种载体，其含有本专利技术所述的DNA分子。本专利技术的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本专利技术所述的DNA分子，或者含有本专利技术所述的载体。上述载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。本专利技术还提供了本专利技术所述的具有耐高温、较宽的pH稳定性、对胰蛋白酶耐受性提高的假密环菌(Armillariellatabescens)来源的β-甘露聚糖酶MAN47突变体的生产方法，包括：在适于mMAN47体表达的条件下培养本专利技术所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的mMAN47。当本专利技术所述的DNA分子以合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体，或者转入所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定点突变的甘露聚糖酶，其特征在于：它是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于Armillariella tabescens的β‑甘露聚糖酶MAN47中制造多个氨基酸取代而产生的突变体，所述的氨基酸取代包括第197、280、380位的取代。

【技术特征摘要】
1.一种定点突变的甘露聚糖酶，其特征在于：它是由氨基酸序列为SEQIDNO.1的来源于Armillariellatabescens的β-甘露聚糖酶MAN47中制造多个氨基酸取代而产生的突变体，所述的氨基酸取代包括第197、280、380位的取代。2.根据权利要求1所述的定点突变的甘露聚糖酶，其特征在于：所述第197位的氨基酸取代是用亮氨酸(Leucine,Leu,L)取代异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I)；第280位的氨基酸取代是用天冬酰胺(Asparagine,Asn,N)取代赖氨酸(Lysine,Lys,K)；第380位的氨基酸取代是用丙氨酸(Alanine,Ala,A)取代缬氨酸(Valine,Val,V)；所述定点突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚冬生，虞晓丹，吕晓慧，胡凤娟，谢春芳，刘大岭，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44