一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种β‑葡萄糖苷酶及其制备方法和应用，属于基因工程技术及生物医药领域。该β‑葡萄糖苷酶选自如下1)或2)的蛋白质：1)序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸组成的蛋白质；2)将1)所示的蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖苷酶活性的蛋白质。本发明专利技术提供的β‑葡萄糖苷酶具有良好的热稳定性和较宽的pH酶解范围，可用于生产稀有人参皂苷及其混合物，其具有较强的水解能力，可以将把人参皂苷转化成在人参等植物中微量存在的生物活性更高，更容易被人体高效吸收的稀有人参皂苷，能应用在食品及医药健康等多种领域。

A beta glucosidase and preparation method and application thereof

The invention provides a beta glucosidase and preparation method and application thereof, which belongs to the gene engineering technology and biomedical field. The beta glucosidase from 1) or 2) are as follows: 1) the protein amino acid sequence of SEQ ID NO.1 represented by protein; 2) 1) protein amino acid sequence shown by one or several amino acid substitution and deletion and / or add with glycosidase activity protein. Beta glucosidase provided by the invention has good thermal stability and a wide range of enzyme pH, can be used for the production of rare ginsenoside and its mixtures, it has strong ability to hydrolyze, put into ginsenoside in ginseng and other plants in the presence of trace amounts of biological activity is higher, more likely to be absorbed efficiently the body of the rare ginsenoside, can be used in many fields such as health food and medicine.

【技术实现步骤摘要】
一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法和应用。
技术介绍
人参的主要活性成分为人参皂苷。人参皂苷是由糖和苷元相连而成的糖苷类化合物，属于三萜类皂苷。人参皂苷中含量最多的是原人参二醇型(Protopanaxdiol)皂苷和原人参三醇型(Protopanaxtriol)皂苷，原人参二醇型皂苷包括人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、F2、Rg3、Rh2、人参皂苷化合物K(CK)等；原人参三醇型皂苷包括人参皂苷Re、Rg1、Rf、Rg2、Rh1等。其中人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Re、Rg1、Rd的含量较高，而人参皂苷Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、CK等在天然人参中含量只有十万分之几或不存在，为稀有人参皂苷。许多药理研究表明，稀有人参皂苷药理效果更好、更容易吸收入血、生物利用度更高。因此，获得大量的稀有人参皂苷具有重要的社会价值，是众多科研人员研究的热点。传统的炮制方法可以提高这些稀有人参皂苷的含量，但其含量仍然非常低。因此，亟待开展新型绿色环保生产工艺的研究以提高这些稀有人参皂苷的转化率和中药材资源的利用效率，降低稀有人参皂苷的生产成本。常用的水解皂苷的方法有酸水解法、碱水解法和生物转化法。但是它们的水解条件都十分剧烈，不易控制，而且由于在水解过程中能使皂苷元发生脱水、环合、双键位移、取代基位移、构型转化等变化，使水解的副产物增多，目标产物很难得到。更重要的是酸、碱水解法对环境造成很大程度上的危害，所以需要寻找新的转化技术和方法，即能更有效的将低活性、高含量的植物皂苷转化成高活性、天然含量低的单体皂苷，又能做到不给环境造成负担的转化技术和方法。生物转化尤其是酶的区域和立体选择性强、反应条件温和、操作简便、成本较低、公害少，且能完成一些化学合成难以进行的反应，克服了传统酸、碱水解方法的缺陷，又减少了污染物的产生，符合从末端治理向源头控制转化的新型现代生产模式，因而越来越受到重视。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有的水解皂苷的方法副产物多且对环境有害的问题，而提供一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法和应用。本专利技术首先提供一种β-葡萄糖苷酶，是如下1)或2)的蛋白质：1)序列如SEQIDNO.1所示的氨基酸组成的蛋白质；2)将1)所示的蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖苷酶活性的蛋白质。本专利技术还提供一种编码上述β-葡萄糖苷酶DNA，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供含有上述β-葡萄糖苷酶DNA的重组载体。本专利技术还提供由上述重组载体转化寄主细胞得到的重组菌。本专利技术还提供一种β-葡萄糖苷酶的制备方法，该方法包括：将SEQIDNO.2所示的DNA片段插入表达载体获得重组载体，将重组载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得β-葡萄糖苷酶。优选的是，所述的方法包括：步骤一：以提取ThermotoganeapolitanaDSM4359的基因组DNA为模板，用具有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增，得到SEQIDNO.2所示的DNA分子；步骤二：将步骤一获得的DNA分子用NheI和EcorI进行双酶切，酶切产物与经相同酶切的表达载体用T4连接酶16℃连接过夜，得到重组载体；步骤三：将步骤二获得的重组载体转化表达寄主菌感受态细胞，得到重组菌；步骤四：将步骤三得到的重组菌和IPTG加入新鲜培养基中，30℃进行诱导发酵16h，离心收集菌体，破碎菌体后离心，得到β-葡萄糖苷酶。本专利技术还提供上述β-葡萄糖苷酶在制备人参皂苷Rg2或含人参皂苷Rg2混合物中的应用。本专利技术还提供上述β-葡萄糖苷酶在制备人参皂苷Rh1、含人参皂苷Rh1混合物、原人参三醇苷元单体或含原人参三醇苷元单体的混合物中的应用。本专利技术还提供上述β-葡萄糖苷酶在制备人参皂苷Rg3、含人参皂苷Rg3混合物、原人参二醇苷元单体或含原人参二醇苷元单体的混合物中的应用。优选的是，所述的β-葡萄糖苷酶在pH3-10，温度为40℃-100℃条件下反应。本专利技术的有益效果(1)本专利技术提供的β-葡萄糖苷酶具有良好的热稳定性和较宽的pH酶解范围；(2)本专利技术提供的β-葡萄糖苷酶具有高效、专一、副产物少、产率高、产物易于纯化、成本低的优点。(3)本专利技术提供的β-葡萄糖苷酶用于生产稀有人参皂苷及其混合物，其具有较强的水解能力，可以将把人参皂苷转化成在人参等植物中微量存在的生物活性更高，更容易被人体高效吸收的稀有人参皂苷，所述稀有人参皂苷的药理效果得到了认证，可以应用在医药健康等多种领域。附图说明图1为本专利技术β-葡萄糖苷酶最适反应温度的折线图；图2为本专利技术β-葡萄糖苷酶最适反应pH的折线图；图3为本专利技术β-葡萄糖苷酶水解人参皂苷Re的薄层图；图4为本专利技术β-葡萄糖苷酶水解人参皂苷Rg1的薄层图；图5为本专利技术β-葡萄糖苷酶水解人参皂苷Rc、Rd、Rb1、Rb2的薄层图。具体实施方式本专利技术首先提供一种β-葡萄糖苷酶，是如下1)或2)的蛋白质：1)序列如SEQIDNO.1所示的氨基酸组成的蛋白质；2)将1)所示的蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖苷酶活性的蛋白质。上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖苷酶活性的蛋白质为不超过40个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。本专利技术还提供一种编码上述β-葡萄糖苷酶DNA，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供含有上述β-葡萄糖苷酶DNA的重组载体。本专利技术还提供由上述重组载体转化寄主细胞得到的重组菌。本专利技术还提供一种β-葡萄糖苷酶的制备方法，该方法包括：将SEQIDNO.2所示的DNA片段插入表达载体获得重组载体，将重组载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得β-葡萄糖苷酶。按照本专利技术，所述的制备方法步骤如下：步骤一：以提取ThermotoganeapolitanaDSM4359的基因组DNA为模板，用具有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增，得到SEQIDNO.2所示的DNA分子；所述的扩增条件优选为：先95℃预变性4min，然后95℃50s，55℃45s，72℃1min30s，共30个循环，最后72℃延伸10min，回收上述PCR反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测；步骤二：将步骤一获得的DNA分子用NheI和EcorI进行双酶切，酶切产物与经相同酶切的表达载体用T4连接酶16℃连接过夜，得到重组载体；所述的表达载体优选为pET28a载体；步骤三：将步骤二获得的重组载体转化表达寄主菌感受态细胞，得到重组菌；所述的转化表达寄主菌为大肠杆菌表达菌株，优选为大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)菌株；步骤四：将步骤三得到的重组菌和IPTG加入新鲜培养基中，30℃进行诱导发酵16h，离心收集菌体，破碎菌体后离心，得到β-葡萄糖苷酶。按照本专利技术，所述的重组菌在加入新鲜培养基前，优选将重组菌单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集发酵液，将发酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种β‑葡萄糖苷酶，其特征在于，是如下1)或2)的蛋白质：1)序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸组成的蛋白质；2)将1)所示的蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖苷酶活性的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种β-葡萄糖苷酶，其特征在于，是如下1)或2)的蛋白质：1)序列如SEQIDNO.1所示的氨基酸组成的蛋白质；2)将1)所示的蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖苷酶活性的蛋白质。2.编码权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶DNA，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.含有权利要求2所述的β-葡萄糖苷酶DNA的重组载体。4.权利要求3所述的重组载体转化寄主细胞得到的重组菌。5.根据权利要求1所述的一种β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，该方法包括：将SEQIDNO.2所示的DNA片段插入表达载体获得重组载体，将重组载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得β-葡萄糖苷酶。6.根据权利要求5所述的一种β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，所述的方法包括：步骤一：以提取ThermotoganeapolitanaDSM4359的基因组DNA为模板，用具有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕云枫，刘景圣，郗昕，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22