The invention discloses a preparation method of Listeria monocytogenes Lester bacteria immunomagnetic beads, the specific steps are as follows: preparation of the antigen; antibody preparation; polyclonal antibodies; bead preparation; magnetic chitosan microspheres; magnetic chitosan microspheres conjugated polyclonal antibody and amino modified: add EDC HCL solution, glutaraldehyde, Rabbit anti Listeria bacteria Lester polyclonal antibody solution, with PBS solution diluted to 2ml, incubated at room temperature for 5 15min; remove the supernatant in the external magnetic field, the use of PBS solution, repeated washing, until the supernatant protein was 0, supernatant; 5%BSA solution, adding magnetic chitosan microspheres amino modified 2 times the volume of the incubation, the magnetic chitosan microsphere coupling blocking antibody; under the external magnetic field, the supernatant was removed and the use of PBS cleaning solution containing 20 0.05%Tween coupling polyclonal The immunomagnetic beads were then repeatedly dried and dried at room temperature for 24h of the immunomagnetic beads. The invention has the advantages of high efficiency, good sensitivity and so on.
【技术实现步骤摘要】
一种单核细胞增生李斯特菌免疫磁珠的制备方法
本专利技术涉及纳米材料领域，具体来说是一种单核细胞增生李斯特菌免疫磁珠的制备方法。
技术介绍
单核细胞增生李斯特菌简称单增李斯特菌，是李斯特菌属中最重要的人类食源性病原菌，可以感染人和多种动物，引起人和动物脑膜炎、败血症、流产等症状,该菌在自然界中分布广泛，并且在4℃冰箱保存的食物中仍能生长繁殖,是冷藏食品中威胁人类健康的主要病原菌之一,极易污染肉、蛋、海产品、乳制品、蔬菜等食品，引起食物中毒和李斯特菌病的发生，尤其在欧美等发达国家经常发生，给人类健康和食品工业造成严重的危害。然而目前对于致病菌的检测，一般需要较复杂的样本处理及长时间的预增菌，来达到方法的检测灵敏度,因此开发一种快速、灵敏、准且、简便的检测方法具有尤为重要的意义。另一方面单一的免疫检测技术检测限往往较高，难以体现免疫检测技术的优势，已有研究者尝试将免疫检测技术与其他技术相结合或者两种免疫技术相结合来改进这一缺陷,目前已有免疫磁性微球富集技术与PCR技术相结合检测沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的报道,与单一PCR技术相比较，检测速度明显提高，但是仍然存...
【技术保护点】
一种单核细胞增生李斯特菌免疫磁珠的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：一、抗原制备：1.1、单增李斯特菌于LB平板上划线，37℃过夜培养；1.2、挑取李斯特菌落至10ml LB液体培养基中，摇菌；1.3、再按1％接种量扩大培养，37℃，180r/min的条件下，摇菌24h；1.4、加入体积浓度为40％的甲醛溶液，使甲醛溶液的最终体积浓度为0.3％，室温灭活24h；1.5、将菌液离心4‑8min，收集菌体，再加入PBS溶液重悬菌体，然后离心3‑6min，去上清，重复3次；1.6、使用200w超声波破碎仪破碎菌体，连续破碎30个循环，每循环5s，间隔9s；1.7、在12000r...
【技术特征摘要】
1.一种单核细胞增生李斯特菌免疫磁珠的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：一、抗原制备：1.1、单增李斯特菌于LB平板上划线，37℃过夜培养；1.2、挑取李斯特菌落至10mlLB液体培养基中，摇菌；1.3、再按1％接种量扩大培养，37℃，180r/min的条件下，摇菌24h；1.4、加入体积浓度为40％的甲醛溶液，使甲醛溶液的最终体积浓度为0.3％，室温灭活24h；1.5、将菌液离心4-8min，收集菌体，再加入PBS溶液重悬菌体，然后离心3-6min，去上清，重复3次；1.6、使用200w超声波破碎仪破碎菌体，连续破碎30个循环，每循环5s，间隔9s；1.7、在12000r/min的条件下离心5-15min，收集细胞碎片，无菌水重悬，制备得到抗原备用；二、抗体制备：2.1、取体重2.0kg健康纯种新西兰白兔，进行基础免疫，即取0.5ml上述抗原与弗氏完全佐剂1:1混匀，颈背部皮下多点注射，耳缘静脉每点注射0.1ml，3天后加强免疫，即取0.7ml抗原与弗氏不完全佐剂1:1混匀，颈背部每点注射0.1ml，耳缘静脉每点注射0.2ml，第5、7、9、11、13天采用和第3天一样的加强免疫；2.2、6天后，颈动脉取血，置于无菌试管中，待凝固后收集血清，制备得到抗体备用；三、多克隆抗体纯化：采用ProteinA亲和层析柱法：先用5-10倍柱体积的去离子水以25ml/min的速度洗出保护剂溶液，然后用平衡缓冲液平衡柱子，上样后继续用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，每管1ml，加入50μL中和缓冲液，冷冻干燥；四、磁珠制备：4.1、在通氮气的条件下，将12.1gFeSO4·7H2O、23.5gFeCl3·6H2O溶解于800ml蒸馏水中，加热回流，加热至90℃时，在机械搅拌下快速把30ml氨水加入以上溶液中；4.2、1h后反应结束，在外加磁场作用下，弃上清；4.3、加入100ml乙醇，充分搅拌洗涤磁珠，在外加磁场下，收集磁珠，再用100ml蒸馏水洗涤，常温下真空干燥，即得Fe3O4纳米磁珠；五、磁性壳聚糖微球制备：5.1、称取10克壳聚糖加到200ml2％乙酸溶液中浸泡过夜，使之溶解；5.2、取1gFe3O4纳米磁珠加入其中，室温下，300r/min条件下搅拌20min；5.3、然后加入200ml液体石蜡油，40℃下，300r/min条件下搅拌30min；5.4、温度升高至50℃，加入40ml甲醛，300r/min条件下，搅拌30min；5.5、向混合溶液中加入20ml50％体积浓度的戊二醛，170r/min，60℃条件下搅拌，调节pH为10，搅拌4h；5.6、反应结束后向反应体系中加入100ml石油醚，充分搅拌，用布氏漏斗进...
【专利技术属性】
技术研发人员：韦玉军，李航，陆宝石，苏军，吴远航，
申请(专利权)人：安徽安龙基因医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34
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