一种抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的制备方法和用途技术

本发明专利技术公开一种抗细胞质胸苷激酶‑IgG抗体的制备方法和用途，设计用人的抗细胞质胸苷激酶TK1的全长重组蛋白作为抗原，制备抗细胞质胸苷激酶‑IgG抗体以及用上述抗体制备的试剂盒在肿瘤诊断中的应用。TK1的全长氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同。本发明专利技术同时提供了应用该抗原制备的抗细胞质胸苷激酶‑IgG抗体及试剂盒产品的制备工艺和检测方法，本发明专利技术提供的抗体试剂盒具有检测灵敏度高、抗体理化性质稳定、检测成本低廉等特点，通过酶联免疫法和免疫组化检测法能够定性和定量的对多种肿瘤进行早期检测、鉴别和预后检测。

Preparation method and application of antibody against cytoplasmic thymidine kinase -IgG

Preparation method and use of the invention discloses an anti IgG antibody thymidine kinase, designed by human anti thymidine kinase TK1 full-length recombinant protein as antigen, preparation of thymidine kinase anti IgG antibody and the antibody preparation kit in tumor diagnosis. The full-length TK1 sequence of amino acids and SEQ ID NO.1. The invention also provides a preparation process and application of the detection method of antigen preparation of thymidine kinase anti IgG antibody and antibody kit, the kit provided by the invention has high sensitivity, stable properties and physicochemical characteristics of antibody detection of low cost, through ELISA and immunohistochemistry detection method can qualitatively and quantitatively detect the identification and early detection and prognosis of tumor.

【技术实现步骤摘要】
一种抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的制备方法和用途
本专利技术涉及一种抗体的制备方法和用途，具体涉及一种抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的制备方法和用途。
技术介绍
本专利技术涉及用用人的TK1全长重组蛋白作为抗原,制备抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体和以IgG抗体为有效成分的肿瘤诊断试剂盒。癌症是一种细胞异常增殖疾病。当正常细胞生长调控失控，导致细胞恶性增殖，是导致人类死亡的杀手。死亡人数每年在增加。尽管近年来化疗，手术，放疗和内分泌治疗等，已经有了很大的进步，但远远不可能达到肿瘤的根治，并有复发和转移的可能。因此，早期的发现和早期的治疗将给予患者康复最佳的福音。现在国内已有数十种肿瘤标记物如AFP(甲胎蛋白)、CEA(癌胚抗原)、HCG(绒毛膜促性腺激素)、PSA(前列腺特别抗原)、VCA(喉癌抗原)、CA(癌抗原)等，但这些肿瘤标记物或受限于个别器官，或灵敏度低。临床应用证实现有一系列单克隆抗体，如CEA，CA19-9，CA125，CA15-3，由于其特异性不理想，在临床上应用仍有争议。用来检测肠癌的CA19-9、乳腺癌的CA-15-3，由于其监控治疗效果的不理想，2002年美国临床肿瘤协会已不推荐使用。肿瘤特别是恶性肿瘤的早期诊断中，肿瘤标记物的检测已成为临床诊断的重要手段，在体检及临床中的恶性增殖病变筛查和治疗后的跟踪监测等具有广泛的使用价值。胸苷激酶(TK)的酶学命名为腺苷三磷酸:胸苷5，-磷酸转移酶，EC.2.7.1.21,简称胸苷激酶TK，是一种嘧啶补救途径的激酶，在ATP为供体和镁离子参与的条件下，催化脱氧胸苷为一腺胸苷酸。人细胞中TK以两种同功酶的形式出现，即TK1（位在于染色体17q23.2–q25.3）和TK2（位于染色体16q22–q23.1）。存TK1在于细胞质中，与细胞的分裂相关，称为细胞质胸苷激酶；TK2存在于线粒体中，其表达与细胞周期无关，称为线粒体胸苷激酶。TK1的水平升降与DNA在细胞周期的S期DNA合成速度密切相关，正常增殖细胞TK1的水平在细胞周期的G1和S期交界处开始升高，随着细胞进入G1晚期,TK1酶的水平逐渐急剧上升,直至S和G2期交界处。因此，TK1酶被称为一种嘧啶补救合成的DNA的关键酶和S-期特殊酶。TK2则仅能在静止期细胞中见到，在增殖细胞中水平非常低。70年代以来，TK酶的研究引起了广泛的关注，特别是TK1与细胞增殖的密切相关特征，即非增殖细胞的TK1和健康人血清和组织中TK1，其含量极微或检测不到；但在恶性肿瘤患者中，TK1酶伴随着肿瘤细胞数的急剧增殖而升高。因此，TK1可以作为一种好的血清学细胞增殖标志来检测增殖细胞的增殖活性，特别适用于恶性肿瘤的细胞增殖度检测。目前，已有利用胸苷类似物，[125I]-5-碘-2´脱氧尿苷作为底物，检测血清TK1(STK)的放射性同位素方法的试剂盒(TK-REA-kit-[125I]-radio-assay)出售，此方法主要是采用TK活性检测实体肿瘤细胞增殖度。但放射性同位素[125I]-5-碘–2´-脱氧尿苷并非是TK1活性分析的专一性底物，它的半衰期仅在4星期，并且在血清TK的活性测定中，对pH和温度非常敏感，常产生不准确结果；并且需要使用贵重的检测仪器((γ闪烁仪)。这种检测具有放射性污染且需要特别的设备和熟练技术人员操作，因此在临床应用上有很大的局限性。且已有研究显示TK1活性检测方法并不适用于实体癌患者的监测和预后。制备抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体在国内尚未有报道。采用双抗体夹心法检测血清中TK1，应用于体检及临床中的恶性增殖病变筛查和治疗后的跟踪监测，目前在国内外尚属首创。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的制备方法和用途，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。本专利技术设计用人的TK1的全长重组蛋白作为抗原，制备抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体以及用上述抗体制备的试剂盒在肿瘤诊断中的应用。本专利技术所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是细胞质胸苷激酶TK1，其的全长氨基酸序列与SEQIDNO.1相同，MSCINLPTVLPGSPSKTRGQIQVILGPMFSGKSTELMRRVRRFQIAQYKCLVIKYAKDTRYSSSFCTHDRNTMEALPACLLRDVAQEALGVAVIGIDEGQFFPDIVEFCEAMANAGKTVIVAALDGTFQRKPFGAILNLVPLAESVVKLTAVCMECFREAAYTKRLGTEKEVEVIGGADKYHSVCRLCYFKKASGQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQQILQCSPAN。一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是应用细胞质胸苷激酶TK1作为抗原制备的抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体。一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体。本专利技术提供的抗体试剂盒具有检测灵敏度高、抗体理化性质稳定、检测成本低廉等特点，通过酶联免疫法和免疫组化检测法能够定性和定量的对多种肿瘤进行早期检测、鉴别和预后检测。一种抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：采用细胞质胸苷激酶TK1全长重组蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠，获得抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体，最后制备和纯化了抗TK1-IgG抗体。进一步，包含以下步骤：（1）抗原的设计所述抗原的氨基酸序列共包含234个氨基酸，是TK1的全长重组蛋白，对肿瘤细胞TK1分子特异性更强。细胞质胸苷激酶TK1的氨基酸全长序列：HumanTK1full-lengthORF(AAH07986.1,1a.a.-234a.a.)recombinantproteinwithGST-tagatN-terminal与SEQIDNO.1相同。MSCINLPTVLPGSPSKTRGQIQVILGPMFSGKSTELMRRVRRFQIAQYKCLVIKYAKDTRYSSSFCTHDRNTMEALPACLLRDVAQEALGVAVIGIDEGQFFPDIVEFCEAMANAGKTVIVAALDGTFQRKPFGAILNLVPLAESVVKLTAVCMECFREAAYTKRLGTEKEVEVIGGADKYHSVCRLCYFKKASGQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQQILQCSPAN专利技术人采用TK1的全长重组蛋白作为抗原制备的TK1-IgG单克隆抗体对多种肿瘤血清学及组织学标本进行检测，检测的阳性率为87%-96%，高于常规肿瘤标志物检出率。获得针对TK1蛋白构象表位的IgG抗体，其检测灵敏度优于多肽制备的针对线性表位的抗体，可检测待测血样中ng甚至pg级的TK1蛋白；同时假阴性和假阳性的检出率低。该抗体制备的检测试剂盒，检测中所需要的待测血样量少，30ul即可完成多项检测，是已有同类型产品待测血样需求量的三分之一。(2)抗体的制备和纯化用上述抗原去免疫小鼠制备的抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的方法，制备的IgG抗体与IgA、IgM、IgD、IgE其它类型抗体相比，具有更高的亲和力。我们免疫过程中不需要BSA作为偶联分子，去除了BSA对抗体制备效果的影响。同时，全蛋白作为免疫原制备获得的抗体，可获本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗细胞质胸苷激酶‑IgG抗体的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：采用细胞质胸苷激酶TK1全长重组蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠，获得抗细胞质胸苷激酶‑IgG抗体，最后制备和纯化了抗TK1‑IgG抗体。

【技术特征摘要】
1.一种抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：采用细胞质胸苷激酶TK1全长重组蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠，获得抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体，最后制备和纯化了抗TK1-IgG抗体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包含以下步骤：（1）抗原的设计所述抗原的氨基酸序列共包含234个氨基酸，是细胞质胸苷激酶TK1的全长重组蛋白，对肿瘤细胞TK1分子特异性更强；细胞质胸苷激酶TK1的氨基酸全长序列：HumanTK1full-lengthORF(AAH07986.1,1a.a.-234a.a.)recombinantproteinwithGST-tagatN-terminal与SEQIDNO.1相同；(2)抗体的制备和纯化用上述抗原去免疫小鼠制备的抗细胞质胸苷激酶-IgG抗体的方法，制备的IgG抗体与IgA、IgM、IgD、IgE其它类型抗体相比，具有更高的亲和力，同时，全蛋白作为免疫原制备获得的抗体，可获得针对TK1蛋白构象表位和线性表位的不同IgG单抗，比单纯用人工合成的多肽制备针对线性表位的抗体，对肿瘤细胞TK1分子特异性更强；利用上述抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选出分泌抗TK1-IgG的阳性克隆，收集阳性克隆细胞的培养上清液，利用亲和柱进行纯化，制备出与天然TK1分子有特异免疫反应的抗TK1-IgG抗体；（3）TK...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国民，王业启，汤蔚莉，王滟，
申请(专利权)人：杨国民，
类型：发明
国别省市：上海,31