一种多倍体华石斛的培育方法技术

本发明专利技术公开了一种多倍体华石斛的培育方法。本发明专利技术保护多倍体华石斛选育方法，包括如下步骤：使用液相的诱变剂对华石斛原球茎进行诱变处理；所述诱变剂中含有浓度为0.1‑1g/L的秋水仙碱。本发明专利技术提供的方法整个过程在可控条件下进行，不受季节限制，还大大减少了嵌合体的出现，提高了鉴定效率，为获得优质华石斛新种质、解决华石斛人工栽培出瓶率低、加速华石斛良种的规模化栽培等提供理论依据和技术参考，同时还具有丰富药用种质资源、防止野生资源的过度利用等重要的现实意义。

Cultivation method of polyploid Dendrobium

The invention discloses a method for cultivating polyploid dendrobium. The invention protects the polyploid breeding method of Dendrobium sinense, which comprises the following steps: using liquid phase mutagens of Dendrobium sinense protocorms were treated; the mutagen contains a concentration of 0.1 1g/L colchicine. The present invention provides a method for the whole process under controllable conditions, not limited by season, but also greatly reduces the chimera, improve the identification efficiency, in order to obtain new germplasm and quality of Dendrobium sinense to solve the artificial cultivation of Dendrobium sinense bottle rate low, accelerate seed scale cultivation of Dendrobium sinense and provide theoretical basis and reference at the same time, also has the practical significance of rich germplasm resources, wild medicinal to prevent the excessive use of resources and other important.

【技术实现步骤摘要】
一种多倍体华石斛的培育方法
本专利技术涉及植物多倍体培育
，具体涉及一种多倍体华石斛的培育方法。
技术介绍
华石斛(Dendrobiumsinense)为兰科石斛属植物，是海南特有种，生于海拔1000米以上的高山云雾林中，常附生于树干上。华石斛集药用和观赏价值于一体，目前，已从华石斛中分离得到了一系列化合物，诸如芪类、生物碱类、多糖类等，具有显著抗肿瘤、抗氧化、抗菌等生物活性，是一种极具开发和推广利用前景的药用兰科植物。华石斛对温度、湿度、光照等各种自然条件要求都非常高，种子在自然生境下萌发率较低；而通过人工引种驯化则受海拔和温度的限制；通过无菌播种可以获得大量组培幼苗，但幼苗生长纤弱，出瓶死亡率极高，以上原因都很大程度上影响了华石斛规模化、产业化的生产和市场化的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种多倍体华石斛的培育方法。本专利技术提供了一种多倍体华石斛选育方法，包括如下步骤：使用液相的诱变剂对华石斛原球茎进行诱变处理；所述诱变剂中含有浓度为0.1-1g/L的秋水仙碱。所述诱变剂中具体含有浓度为1g/L的秋水仙碱。所述诱变剂中具体含有浓度为0.1g/L的秋水仙碱。所述诱变剂中具体含有浓度为0.5g/L的秋水仙碱。所述诱变剂中还含有浓度为15g/L的蔗糖。所述诱变剂具体可为含0.1-1g/L秋水仙碱的液体1/2MS培养基。所述诱变剂具体可为含1g/L秋水仙碱的液体1/2MS培养基。所述诱变剂具体可为含0.1g/L秋水仙碱的液体1/2MS培养基。所述诱变剂具体可为含0.5g/L秋水仙碱的液体1/2MS培养基。所述诱变剂具体可为含0.1-1g/L秋水仙碱和14-16g/L蔗糖的液体1/2MS培养基。所述诱变剂具体可为含1g/L秋水仙碱和15g/L蔗糖的液体1/2MS培养基。所述诱变剂具体可为含0.1g/L秋水仙碱和15g/L蔗糖的液体1/2MS培养基。所述诱变剂具体可为含0.5g/L秋水仙碱和15g/L蔗糖的液体1/2MS培养基。进行所述诱变处理时，所述华石斛原球茎处于原胚期。所述诱变处理条件可为：25℃、50r/min诱变处理2-10天。所述诱变处理条件具体可为：25℃、50r/min诱变处理8天。所述诱变处理条件具体可为：25℃、50r/min诱变处理10天。所述诱变处理条件具体可为：25℃、50r/min诱变处理6天。所述诱变处理条件具体可为：25℃、50r/min诱变处理4天。所述诱变处理条件具体可为：25℃、50r/min诱变处理2天。本专利技术还保护多倍体华石斛选育方法(方法A)，包括如下步骤：(1)取华石斛原球茎，接种至诱变培养基中进行诱变处理；(2)将步骤(1)处理后的原球茎接种至复壮分化培养基中培养，得到幼苗；(3)从步骤(2)得到的幼苗中筛选得到多倍体华石斛幼苗。本专利技术还保护多倍体华石斛选育方法(方法B)，包括如下步骤：(1)取华石斛原球茎，接种至诱变培养基中进行诱变处理；(2)将步骤(1)处理后的原球茎接种至复壮分化培养基中培养，得到幼苗；(3)从步骤(2)得到的幼苗中筛选得到多倍体华石斛幼苗；(4)栽培步骤(3)得到的多倍体华石斛幼苗，得到多倍体华石斛。所述方法A或方法B中，所述步骤(1)中所述华石斛原球茎处于原胚期。以上任一所述华石斛原球茎的制备方法为：将华石斛蒴果中散粉的种子接种至播种培养基中培养，得到华石斛原球茎。所述培养条件为：光照12h(温度：26℃，光照强度2000lx)/黑暗12h(温度：21℃)。所述培养时间为：30-50天，直至得到原胚期原球茎。所述华石斛蒴果的选取原则为：从生长旺盛、茎秆粗壮、茎高长、分蘖多、开花数量大的华石斛植株上采集成熟度85％-90％的蒴果。所述方法A或方法B中，所述步骤(1)中，所述诱变处理的条件为：25℃、50r/min诱变处理2-10天。所述诱变处理条件具体可为：25℃、50r/min诱变处理8天。所述诱变处理条件具体可为：25℃、50r/min诱变处理10天。所述诱变处理条件具体可为：25℃、50r/min诱变处理6天。所述诱变处理条件具体可为：25℃、50r/min诱变处理4天。所述诱变处理条件具体可为：25℃、50r/min诱变处理2天。所述方法A或方法B中，所述步骤(2)中，培养条件为：光照12h(温度：26℃，光照强度2000lx)/黑暗12h(温度：21℃)。所述得到幼苗为得到具有4-6片真叶的幼苗。所述方法A或方法B中，筛选多倍体华石斛幼苗的方法包括如下步骤(a)-(d)：(a)取所述幼苗，进行形态学鉴定，获得候选的多倍体华石斛；(b)取步骤(a)获得的候选的多倍体华石斛，进行分子生物学鉴定，获得候选的多倍体华石斛；(c)取步骤(b)获得的候选的多倍体华石斛，进行细胞学鉴定，获得候选的多倍体华石斛；(d)取步骤(c)获得的候选的多倍体华石斛，进行染色体组学鉴定，获得多倍体华石斛。所述形态学鉴定包括叶形指数、叶色、株高、茎粗、根长和根粗测定。满足表1所示标准的为候选的四倍体华石斛。所述分子生物学鉴定包括相对DNA含量测定。所述测定方法具体为：取幼苗，随机取1-2片叶子、1-2条根和0.5cm左右茎段，混合切碎后采用GLB解离液和DAPI染色，采用流式细胞仪检测相对DNA含量。所述染色步骤可为：随机取叶子、根和茎段，混合后一起放入GLB解离液浸润并切碎，静置2min，用300目的尼龙网筛过滤，再加入RNase酶孵化5min，再加入DAPI染色液，混匀避光10min。所述染色步骤具体可为：随机取1-2片叶子、1-2条根和0.5cm左右茎段，一起放入1mLGLB解离液浸润并切碎，静置2min，用300目的尼龙网筛过滤，再加入RNase孵化5min，再加入DAPI染色液200μL，混匀避光10min。以二倍体华石斛作为参照，相对DNA含量为二倍体华石斛2倍的为候选的四倍体华石斛。所述细胞学鉴定包括单位视野气孔个数、气孔周长和保卫细胞叶绿体数量测定。所述方法为：取叶片下表皮(具体可早8:00-10:00取幼苗舒展的第3片真叶)制片。当需要筛选四倍体华石斛时，满足表2所示标准且以二倍体华石斛作为参照，保卫细胞叶绿体数量增加的候选为四倍体华石斛。所述染色体组学鉴定包括根尖染色体数目测定。所述方法为：取幼嫩根尖(具体可上午8:00-10:00剪取)，二氯苯饱和溶液预处理4小时，再转入乙醇∶冰醋酸(3∶1，体积比)中固定24小时，1M盐酸水溶液37℃解离30min，卡宝染色液染色12h。当需要筛选四倍体华石斛时，染色体数2n＝76的华石斛候选为四倍体华石斛。所述方法B中，所述步骤(4)具体可为：将步骤(3)筛选得到的幼苗置于复壮分化培养基中培养，至生长出3-6片真叶后，置于大棚中10-15天后取出，放置1-2天后，待幼苗根部发白，移栽至培养基质中培养，得到多倍体华石斛。所述复壮分化培养基中培养的培养条件为：光照12h(温度：26℃，光照强度2000lx)/黑暗12h(温度：21℃)。所述培养基质由1体积份陶粒、2体积份碎树皮和1体积份水苔组成。以上任一所述方法中，所述多倍体华石斛具体可为四倍体华石斛。以上任一所述诱变培养基为液体培养基，含0.1-1g/L秋水仙碱和14-16g/L蔗糖。所述诱变培养基为液体培养基，含1g/L秋水仙碱本文档来自技高网...

【技术保护点】
多倍体华石斛选育方法，包括如下步骤：使用液相的诱变剂对华石斛原球茎进行诱变处理；所述诱变剂中含有浓度为0.1‑1g/L的秋水仙碱。

【技术特征摘要】
1.多倍体华石斛选育方法，包括如下步骤：使用液相的诱变剂对华石斛原球茎进行诱变处理；所述诱变剂中含有浓度为0.1-1g/L的秋水仙碱。2.多倍体华石斛选育方法，包括如下步骤：(1)取华石斛原球茎，接种至诱变培养基中进行诱变处理；(2)将步骤(1)处理后的原球茎接种至复壮分化培养基中培养，得到幼苗；(3)从步骤(2)得到的幼苗中筛选得到多倍体华石斛幼苗；所述诱变培养基为液体培养基，含0.1-1g/L秋水仙碱和14-16g/L蔗糖；所述复壮分化培养基为固体培养基，含1-3g/L花宝一号、1-2g/L活性炭碳粉、30-70g/L香蕉和14-16g/L蔗糖。3.多倍体华石斛选育方法，包括如下步骤：(1)取华石斛原球茎，接种至诱变培养基中进行诱变处理；(2)将步骤(1)处理后的原球茎接种至复壮分化培养基中培养，得到幼苗；(3)对步骤(2)得到的幼苗进行鉴定，筛选得到多倍体华石斛幼苗；(4)栽培步骤(3)得到的多倍体华石斛幼苗，得到多倍体华石斛；所述诱变培养基为液体培养基，含0.1-1g/L秋水仙碱和14-16g/L蔗糖；所述复壮分化培养基为固体培养基，含1-3g/L花宝一号、1-2g/L活性炭碳粉、30-70g/L香蕉和14-16g/L蔗糖。4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述诱变培养基为液体培养基，含1g/L秋水仙碱和15g/L蔗糖；所述复壮分化培养基为...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋希强，吴姝漪，凌鹏，赵莹，马香，朱婕，周扬，杨泽秀，王晓鸣，方赞山，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南,46