一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法及其培养基技术

本发明专利技术提供一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法及其培养基，属于植物细胞工程技术领域。所述方法包括以下步骤：摘取现蕾期至初花期的马铃薯四倍体栽培种花蕾放入4～6℃环境中预处理48～72h；花蕾进行灭菌后，挑取花蕾中的花药接种于诱导培养基，在30～35℃条件下处理48～72h，再在22～26℃条件下诱导培养40～50d；将获得的花药愈伤组织，转入分化培养基中进行分化培养60～80d，挑取分化出绿色芽点的愈伤组织转入分化培养基中进行继代培养30‑50d，获得马铃薯小苗；将马铃薯小苗转入生根培养基中培养，获得马铃薯完整植株。试验表明，分化率达到6.1～16.9％，成功获得双单倍体植株。

Method for obtaining potato double haploid plant by anther culture and culture medium thereof

The invention provides a method for obtaining potato double haploid plants by anther culture and a culture medium thereof, belonging to the technical field of plant cell engineering. The method comprises the following steps: from bud stage to flowering stage of potato tetraploid cultivar buds into 4 ~ 6 DEG C pretreatment for 48 ~ 72h; buds after sterilization, inoculation were in bud induction medium, at 30 to 35 DEG C under the condition of 48 ~ 72h, and then in 22 ~ 26 Deg. C induced 40 ~ 50D; the anther callus transferred to differentiation medium differentiation culture of 60 ~ 80D, were differentiated from bud callus transferred to differentiation medium for subculture 30 50D, obtain the potato seedlings; the potato seedlings into the medium. For rooting, potato plants. The results showed that the rate of differentiation was 6.1 ~ 16.9%, and double haploid plants were successfully obtained.

【技术实现步骤摘要】
一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法及其培养基
本专利技术属于植物细胞工程
，具体涉及一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法及其培养基。
技术介绍
马铃薯(SolanumtuberosumL.)为茄科茄属植物，是重要的粮食和蔬菜兼用作物。目前，我国马铃薯的生产与消费均居于世界前列，其种植面积约600万公顷，总产量达1亿吨。宁夏南部山区是我国重要的马铃薯优势产区，气候特点及土壤条件十分适合马铃薯的生长和干物质的积累，生产出的马铃薯淀粉含量高、品质好。至2015年，马铃薯已成为宁夏第一大种植作物，种植面积超过24万公顷，在当地农业产业结构调整、保障粮食安全及农村经济发展中发挥着重要作用。马铃薯种植区多分布在土壤贫瘠的南部山区和中部干旱区，水资源缺乏、干旱、冷害等非生物胁迫频发，加之生产中使用的品种单一，对马铃薯的产量及质量常常造成严重损失，极大地影响了我区马铃薯产业均衡、可持续发展。随着当前马铃薯主粮化战略的推进，在与其他三大主粮不争地的前提条件下，生产上亟需选育具有优良农艺性状、抗逆性强的马铃薯品种，进一步提高马铃薯单产水平，是满足马铃薯产业的发展和保障粮食安全的必然要求。由于马铃薯属于同源四倍体植物，遗传背景狭窄，采用常规育种手段创制马铃薯新种质的困难越来越大，迫切需要通过生物技术手段促进品种选育。花药培养技术是迄今为止创造纯和基因型最有效手段，在育种工作中，利用这项技术除可以大大缩短种质材料的纯化时间，对杂交F1、F2代的花药培养可选择出特异的性状外，还可通过花药培养方法建立DH群体，直接获得纯化品系，作为育种中间材料或亲本育种新品种。将生物技术育种结合于常规育种中，已成为当代作物遗传育种的重要特点。应用花药培养降低作物倍性获得的单倍体植株，无论是在作物的育种，还是在遗传图谱构建、重要性状QTL定位及基因的克隆筛选等分子生物学研究都具有重要应用价值。虽然我国马铃薯花药培养尽管在上世纪80年代初就已经开展，但仍存在着基因型限制、成胚率低等需要克服的问题，限制了单倍体育种技术在育种实践中的应用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法及其培养基，所述方法受基因型的限制小，具有较高的分化率。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的分化培养基，以MS培养基为基础培养基，包括以下组分：质量浓度为0.4～0.6mg/L赤霉素、质量浓度为1.5～3.0mg/L的6-苄氨基嘌呤、质量浓度为2.5～3.5mg/L玉米素、质量浓度为3.0％的蔗糖和质量浓度为0.4％～0.6％的琼脂；所述MS培养基包括以下组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。优选的，所述赤霉素在MS培养基中的质量浓度为0.5mg/L。优选的，所述6-苄氨基嘌呤在MS培养基中的质量浓度为2.0mg/L。优选的，所述玉米素在MS培养基中的质量浓度为3.0mg/L。本专利技术还提供了一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法，包括以下步骤：1)在马铃薯现蕾期至初花期的花蕾放入4～6℃环境中预处理48～72h；2)将所述步骤1)中预处理后的花蕾进行灭菌后，挑取花蕾中的花药接种于诱导培养基中，在30～35℃条件下高温处理48～72h，再在22～26℃条件下诱导培养40～50d，光照条件为黑暗24h，获得花药愈伤组织；3)将所述步骤2)诱导获得的花药愈伤组织，转入所述分化培养基中进行分化培养d，挑取分化出绿色芽点的愈伤组织转入分化培养基中进行继代培养30～50d，获得马铃薯小苗；4)将所述步骤3)中继代分化出的马铃薯小苗转入生根培养基中生根培养，获得马铃薯花药培养完整植株。优选的，所述步骤1)中花蕾长度为4～6mm；花蕾的采集时间为上午9:00～10:00；花蕾的形态为花瓣与花萼等长。优选的，所述步骤2)中花药的长度为2～3mm，花药的颜色为绿色。优选的，所述步骤2)中诱导培养基为以MS培养基为基础培养基，包含附加物和植物激素；所述附加物为下列质量含量的组分：硝酸银30～50mg/L，活性炭1.5～3g/L，蔗糖6％，琼脂0.4～0.6％；所述植物激素包括以下重量含量组分：1mg/L2，4-二氯苯氧乙酸，0.5mg/L萘乙酸，1mg/L激动素。优选的，所述步骤3)中分化培养和继代培养的光照条件为光照16h/黑暗8h，培养温度为22～26℃。优选的，所述步骤4)中生根培养基为以MS培养基为基础培养基，包含质量浓度为0.050.1mg/L的萘乙酸、质量浓度为1.5％的蔗糖和质量浓度为0.4～0.6％琼脂；所述步骤4)中培养时间为30～40d。本专利技术提供了一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的分化培养基，以MS培养基为基础培养基，包括以下组分：质量浓度为0.4～0.6mg/L赤霉素、质量浓度为1.5～3.0mg/L的6-苄氨基嘌呤、质量浓度为2.5～3.5mg/L玉米素、质量浓度为3.0％的蔗糖和质量浓度为0.4％～0.6％的琼脂。所述培养基通过将赤霉素、6-苄氨基嘌呤和玉米素添加到MS培养基中，大大提高了马铃薯花药培养的培养效率，分化率达到6.1～16.9％，较其他常规分化培养基提高了60～120％。本专利技术提供的一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法，通过严格限定花药取材时期及花药低温和高温处理，经花药愈伤组织诱导培养基诱导以及分化培养基分化，获得花药培养植株。与其他马铃薯花药培养方法相比，受基因型限制更小，花药培养植株更易获得，实施例中采用所述方法对7个马铃薯四倍体栽培种(系)花药培养的研究试验表明，7个品种的花药愈伤组织诱导率达到8.0～31.7％，其中5个品种(系)可成功分化诱导出花药植株。通过倍性分析仪的鉴定，筛选获得了双单倍体植株。因此，所述方法为马铃薯倍性育种研究提供重要的理论与实践。附图说明图1为实施例4中马铃薯接种花药与对应的减数分裂时期；图2为实施例4中马铃薯花药诱导出的愈伤组织；图3为实施例4中马铃薯花药愈伤组织分化出苗；图4为实施例4中马铃薯花药培养植株的倍性鉴定；图5为实施例4中马铃薯栽培种及其花药培养双单倍植株形态比较。具体实施方式本专利技术提供了一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的分化培养基，以MS培养基为基础培养基，包括以下组分：质量浓度为0.4～0.6mg/L赤霉素、质量浓度为1.5～3.0mg/L的6-苄氨基嘌呤、质量浓度为2.5～3.5mg/L玉米素、质量浓度为3.0％的蔗糖和质量浓度为0.4％～0.6％的琼脂；所述MS培养基包括以下组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的分化培养基，以MS培养基为基础培养基，包含以下组分：质量浓度为0.4～0.6mg/L赤霉素、质量浓度为1.5～3mg/L的6‑苄氨基嘌呤、质量浓度为2.5～3.5mg/L玉米素、质量浓度为3.0％的蔗糖和质量浓度为0.4％～0.6％的琼脂；所述MS培养基包括以下组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。

【技术特征摘要】
2017.06.20 CN 20171047036731.一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的分化培养基，以MS培养基为基础培养基，包含以下组分：质量浓度为0.4～0.6mg/L赤霉素、质量浓度为1.5～3mg/L的6-苄氨基嘌呤、质量浓度为2.5～3.5mg/L玉米素、质量浓度为3.0％的蔗糖和质量浓度为0.4％～0.6％的琼脂；所述MS培养基包括以下组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。2.根据权利要求1所述的分化培养基，其特征在于，所述赤霉素在MS培养基中的质量浓度为0.5mg/L。3.根据权利要求1所述的分化培养基，其特征在于，所述6-苄氨基嘌呤在MS培养基中的质量浓度为2.0mg/L。4.根据权利要求1所述的分化培养基，其特征在于，所述玉米素在MS培养基中的质量浓度为3.0mg/L。5.一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法，包括以下步骤：1)摘取现蕾期至初花期的花蕾放入4～8℃环境中预处理48～72h；2)将所述步骤1)中预处理后的花蕾进行灭菌后，挑取花蕾中的花药接种于诱导培养基中，在30～35℃条件...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋玉霞，张丽，巩檑，甘晓燕，聂峰杰，陈虞超，石磊，
申请(专利权)人：宁夏农林科学院农业生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：宁夏,64