一种检测VBNC副溶血性弧菌的方法及试剂技术

本发明专利技术涉及一种PMA‑qPCR法检测冷冻基质中VBNC副溶血性弧菌的方法，以及实施所述方法的引物探针组合。本发明专利技术所述PMA‑qPCR检测方法对副溶血性弧菌检测的特异性强、灵敏度高、可重复性好，适用于对冷冻食品中活的非可培养状态的副溶血性弧菌进行检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测VBNC副溶血性弧菌的方法及试剂
本专利技术属于食品检验检疫和分子生物学检测领域，具体涉及一种副溶血性弧菌的检测方法及试剂，特别是涉及一种针对冷冻基质中VBNC副溶血性弧菌的PMA-qPCR检测法。
技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，V.parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性嗜盐性细菌，广泛分布于海洋和盐湖等环境中，主要污染海鱼、虾、贝类和虾等海产品，可引起急性胃肠炎，临床症状包括腹泻、呕吐、恶心、腹部绞痛，低烧，寒战等，近50％以上的食物中毒由副溶血性弧菌引起，是一种重要的食源性致病菌。上海作为全国重要口岸，每年进口大量海产品尤其冰鲜类产品，如大西洋鲑鱼、金枪鱼、海胆等，副溶血性弧菌为这些产品的必检致病微生物。由于新鲜程度是产品质量的关键因素，在海产品制备及运输过程中通常采用冷冻冷藏等处理工艺手段。但与此同时，部分病原菌在低温及消毒剂、防腐剂作用下，可进入亚致死状态即具有活性但不可培养状态。处于VBNC状态的病原菌丧失了在传统培养基上生长繁殖能力，采用常规培养检测法无法检出，但仍保留原有的致病性和毒力因子。更为重要的是，VBN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种活的非可培养状态的副溶血性弧菌的检测方法，包括以下步骤：(1)样品采集及预处理：将样品均匀分散于缓冲液中；(2)PMA反应：向待测样品中加入叠氮溴化丙锭；(3)总DNA的提取：(4)实时荧光PCR检测：针对副溶血弧菌tlh基因进行实时荧光PCR检测。

【技术特征摘要】
1.一种活的非可培养状态的副溶血性弧菌的检测方法，包括以下步骤：(1)样品采集及预处理：将样品均匀分散于缓冲液中；(2)PMA反应：向待测样品中加入叠氮溴化丙锭；(3)总DNA的提取：(4)实时荧光PCR检测：针对副溶血弧菌tlh基因进行实时荧光PCR检测。2.如权利要求1所述活的非可培养状态的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于所述步骤(1)包括无菌采集待检样品置于含有缓冲蛋白胨水的均质袋中，拍打均匀。3.如权利要求1所述活的非可培养状态的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于所述步骤(2)包括以终浓度50μmol/L的量加入叠氮溴化丙锭，混匀，使样品与PMA染料充分接触；避光反应5min取出置于冰上，LED灯照射15min；反应结束后8000r/min离心10min，收集菌体。4.如权利要求1所述活的非可培养状态的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于所述步骤(3)包括用细菌基因组提取试剂盒抽提DNA，-20℃保存备用。5.如权利要求1所述活的非可培养状态的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于所述步骤(4)荧光PCR检测中引物对如SEQIDNO：1-2所示，探针如SEQIDNO：3所示，其中所述探针的5’端标记有荧光发生基团、3’端标记有荧光淬灭基...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄新新，杨娟，蔡强，
申请(专利权)人：上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：上海,31