用于鉴定桉树无性系的STR引物、PCR试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了用于鉴定桉树无性系的STR引物、PCR试剂盒及方法。本发明专利技术通过大量的STR标记分型检测，筛选出了8对多态性高、扩增条带清晰的桉树STR引物用于鉴定桉树无性系，并建立了多重荧光检测体系。将该STR引物组用于鉴定桉树无性系，具有效率高、检测准确、操作方便等优势。本发明专利技术可有效甄别假冒和错乱的无性系，切实保障良种培育人和营林种植者的权益；并可为今后快速进行桉树种质资源遗传评价、遗传图谱构建、分子标记辅助育种、无性系指纹图谱构建和鉴定提供重要的技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定桉树无性系的STR引物、PCR试剂盒及方法
本专利技术属于分子标记
，具体涉及用于鉴定桉树无性系的STR引物及其应用。
技术介绍
桉树是桃金娘科(Myrtaceae)桉属(Eucalyptus)树种的总称，是全球三大造林树种之一。桉树因其遗传多样性丰富、生长迅速、木材产量高和适应性强等特点，在华南地区广泛种植，为缓解我国木材供求紧张的局面发挥了重要的作用。生产中桉树主要以无性系进行繁殖，随着无性系扩繁代数的增加、推广范围的扩大和流通市场的拓展，无性系混乱的问题日益严重，一些无性系名称在组培室和苗圃中被错误记录，市场上还存在以次充好、将表型相似的不良无性系作为优良无性系销售的现象，这极大地损害了种植者的效益。此外，一些单位将别人培育的无性系重新命名、据为己有，不利于知识产权的保护。因此，对桉树无性系进行鉴别尤为重要。国际植物新品种保护联盟(UPOV,InternationalUnionfortheProtectionofNewVarietiesofPlants)对无性系鉴定的传统方法包括：叶片形态、树皮纹理以及果实性状等一系列形态学以及其它的一些解剖学特征，不同人判定标准难以统一，极易造成鉴定不准确，影响生产。DNA分子标记，尤其是短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR)具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，可以为某一品种提供独特的多态性信息，可以用于植物品种准确的检测和鉴定。目前DNA分子标记已广泛应用于许多农作物的种质资源鉴定，桉树中也相继在不同无性系开展了一定的DNA指纹图谱分析工作，但仍没有一套简单易行的STR检测体系和常用桉树无性系的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前桉树无性系种植情况和现有鉴定方法的缺点与不足，提供一组用于鉴定桉树无性系的STR引物组，其可以在桉树常用无性系中进行快捷、方便鉴定的应用。本专利技术通过构建桉树无性系的分子鉴定体系，建立桉树无性系指纹图谱，能有效甄别假冒和错乱的无性系，切实保障良种培育人和营林种植者的权益，提高桉树商品林发展良种化程度。本专利技术的第一个目的是提供用于鉴定桉树无性系的STR引物组。本专利技术的用于鉴定桉树无性系的STR引物组，包括以下8对引物：(1)EUCeSSR0475引物对：其正向引物如SEQIDNO.1所示，其反向引物如SEQIDNO.2所示；(2)EUCeSSR0204引物对：其正向引物如SEQIDNO.3所示，其反向引物如SEQIDNO.4所示；(3)EUCeSSR419引物对：其正向引物如SEQIDNO.5所示，其反向引物如SEQIDNO.6所示；(4)EUCeSSR1128引物对：其正向引物如SEQIDNO.7所示，其反向引物如SEQIDNO.8所示；(5)EUCeSSR298引物对：其正向引物如SEQIDNO.9所示，其反向引物如SEQIDNO.10所示；(6)EUCeSSR0176引物对：其正向引物如SEQIDNO.11所示，其反向引物如SEQIDNO.12所示；(7)EUCeSSR181引物对：其正向引物如SEQIDNO.13所示，其反向引物如SEQIDNO.14所示；(8)EUCeSSR304引物对：其正向引物如SEQIDNO.15所示，其反向引物如SEQIDNO.16所示。本专利技术的第二个目的是提供用于鉴定桉树无性系的PCR试剂盒，包括上述的用于鉴定桉树无性系的STR引物组。优选，所述的PCR试剂盒，包括2xType-itMultiplexPCRMasterMix5μL，RNase-FreeWater1μL，Primers2μL，30ng/μL待测桉树无性系的DNA2μL；其中Primers包含的各引物对在反应体系中的终浓度为：EUCeSSR0475引物对的正向、反向引物各为0.17μM，EUCeSSR0204引物对的正向、反向引物各为0.05μM，EUCeSSR419引物对的正向、反向引物各为0.15μM，EUCeSSR1128引物对的正向、反向引物各为0.33μM，EUCeSSR298引物对的正向、反向引物各为0.19μM，EUCeSSR0176引物对的正向、反向引物各为0.06μM，EUCeSSR181引物对的正向、反向引物各为0.17μM，EUCeSSR304引物对的正向、反向引物各为0.87μM。优选，所述的PCR试剂盒，所述的Primers包含的每个引物对中，至少有一条引物是经过荧光物质标记的，荧光物质加在引物的5'端，EUCeSSR0475引物对、EUCeSSR0204引物对、EUCeSSR419引物对、EUCeSSR1128引物对、EUCeSSR298引物对、EUCeSSR0176引物对、EUCeSSR181引物对、EUCeSSR304引物对标记的荧光物质依次分别是ROX、6-FAM、TAMRA、ROX、TAMRA、6-FAM、HEX、ROX。本专利技术的第三个目的是提供鉴定桉树无性系的方法。所述的鉴定桉树无性系的方法，包括以下步骤：a.提取待测桉树无性系的DNA；b.以步骤a提取的桉树无性系的DNA为模板，利用权利要求1所述的鉴定桉树无性系的STR引物组进行多重PCR扩增，得到PCR产物；c.对PCR产物进行分型，与桉树无性系STR指纹图谱进行比对，确定待测桉树无性系的名称。优选，所述的方法，所述的步骤b中的多重PCR扩增，其反应体系为：2xType-itMultiplexPCRMasterMix5μL，RNase-FreeWater1μL，Primers2μL，30ng/μL待测桉树无性系的DNA2μL；其中Primers包含的各引物对在反应体系中的终浓度为：EUCeSSR0475引物对的正向、反向引物各为0.17μM，EUCeSSR0204引物对的正向、反向引物各为0.05μM，EUCeSSR419引物对的正向、反向引物各为0.15μM，EUCeSSR1128引物对的正向、反向引物各为0.33μM，EUCeSSR298引物对的正向、反向引物各为0.19μM，EUCeSSR0176引物对的正向、反向引物各为0.06μM，EUCeSSR181引物对的正向、反向引物各为0.17μM，EUCeSSR304引物对的正向、反向引物各为0.87μM。上述多重PCR扩增是利用Type-itMicrosatellitePCRKit试剂盒进行(QIAGEN公司，目录号：206241)。优选，所述的Primers包含的每个引物对中，至少有一条引物是经过荧光物质标记的，荧光物质加在引物的5'端，EUCeSSR0475引物对、EUCeSSR0204引物对、EUCeSSR419引物对、EUCeSSR1128引物对、EUCeSSR298引物对、EUCeSSR0176引物对、EUCeSSR181引物对、EUCeSSR304引物对标记的荧光物质依次分别是ROX、6-FAM、TAMRA、ROX、TAMRA、6-FAM、HEX、ROX。优选，所述的步骤b中的多重PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火90s、72℃延伸30s，30个循环；60℃延伸30min；20℃保温。本专利技术的优点在于：(1)本专利技术通过大量的STR标记(400余个)分型检本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定桉树无性系的STR引物组，其特征在于，包括以下8对引物：EUCeSSR0475引物对：其正向引物如SEQ ID NO.1所示，其反向引物如SEQ ID NO.2所示；EUCeSSR0204引物对：其正向引物如SEQ ID NO.3所示，其反向引物如SEQ ID NO.4所示；EUCeSSR419引物对：其正向引物如SEQ ID NO.5所示，其反向引物如SEQ ID NO.6所示；EUCeSSR1128引物对：其正向引物如SEQ ID NO.7所示，其反向引物如SEQ ID NO.8所示；EUCeSSR298引物对：其正向引物如SEQ ID NO.9所示，其反向引物如SEQ ID NO.10所示；EUCeSSR0176引物对：其正向引物如SEQ ID NO.11所示，其反向引物如SEQ ID NO.12所示；EUCeSSR181引物对：其正向引物如SEQ ID NO.13所示，其反向引物如SEQ ID NO.14所示；EUCeSSR304引物对：其正向引物如SEQ ID NO.15所示，其反向引物如SEQ ID NO.16所示。

【技术特征摘要】
1.用于鉴定桉树无性系的STR引物组，其特征在于，包括以下8对引物：EUCeSSR0475引物对：其正向引物如SEQIDNO.1所示，其反向引物如SEQIDNO.2所示；EUCeSSR0204引物对：其正向引物如SEQIDNO.3所示，其反向引物如SEQIDNO.4所示；EUCeSSR419引物对：其正向引物如SEQIDNO.5所示，其反向引物如SEQIDNO.6所示；EUCeSSR1128引物对：其正向引物如SEQIDNO.7所示，其反向引物如SEQIDNO.8所示；EUCeSSR298引物对：其正向引物如SEQIDNO.9所示，其反向引物如SEQIDNO.10所示；EUCeSSR0176引物对：其正向引物如SEQIDNO.11所示，其反向引物如SEQIDNO.12所示；EUCeSSR181引物对：其正向引物如SEQIDNO.13所示，其反向引物如SEQIDNO.14所示；EUCeSSR304引物对：其正向引物如SEQIDNO.15所示，其反向引物如SEQIDNO.16所示。2.用于鉴定桉树无性系的PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的用于鉴定桉树无性系的STR引物组。3.根据权利要求2所述的PCR试剂盒，其特征在于，包括2xType-itMultiplexPCRMasterMix5μL，RNase-FreeWater1μL，Primers2μL，30ng/μL待测桉树无性系的DNA2μL；其中Primers包含的各引物对在反应体系中的终浓度为：EUCeSSR0475引物对的正向、反向引物各为0.17μM，EUCeSSR0204引物对的正向、反向引物各为0.05μM，EUCeSSR419引物对的正向、反向引物各为0.15μM，EUCeSSR1128引物对的正向、反向引物各为0.33μM，EUCeSSR298引物对的正向、反向引物各为0.19μM，EUCeSSR0176引物对的正向、反向引物各为0.06μM，EUCeSSR181引物对的正向、反向引物各为0.17μM，EUCeSSR304引物对的正向、反向引物各为0.87μM。4.根据权利要求3所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述的Primers包含的每个引物对中，至少有一条引物是经过荧光物质标记的，荧光物质加在正向引物的5'端，EUCeSSR0475引物对、EUCeSSR0204引物对、EUCeSSR419引物对、EUCeSSR1128引物对、EUCeSSR298引物对、EUCeSSR017...

【专利技术属性】
技术研发人员：周长品，李昌荣，李发根，翁启杰，陈升侃，王莉，甘四明，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44