用于产前诊断和监测的新的胎儿标志物制造技术

本申请提供新的胎儿标志物在产前诊断和监测某些妊娠相关状态中的用途。更具体地，本发明专利技术基于以下发现，即位于胎儿染色体21上的某些CpG岛显示与位于母体染色体21上相应CpG岛不同的甲基化模式。本申请还提供诊断或者监测相关状态的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
用于产前诊断和监测的新的胎儿标志物相关申请本申请要求享有2006年5月3日提交的美国临时专利申请序列号60/797,456的优先权，其内容通过引用整体并入本文。专利技术背景妊娠相关状态(包括妊娠或者分娩期间的潜在并发症以及胎儿的遗传缺陷)的早期检测非常重要，因为它允许母体和胎儿安全所需的早期医疗介入。通常采用例如绒毛膜绒毛取样(CVS)或者羊膜穿刺术的方法利用从胎儿分离的细胞来进行产前诊断。尽管操作非常仔细，但这些常规方法均是侵入性的，并对母体和胎儿有一定的风险(Taboretal.,Lancet1:1287-1293,1986)。在发现母体循环中存在数种类型的胎儿细胞(Johansenetal.,Prenat.Diagn.15:921-931,1995)之后，更重要的是在发现母体血浆和血清中能够检测到循环的无细胞的胎儿DNA(Loetal.,Lancet350:485-487,1997)之后，已经开发了替代这些侵入性方法的产前筛查方法，例如检测胎儿异常的方法。已证明，母体血液中的胎儿DNA的含量足够用于遗传学分析，与需要分离和富集胎儿细胞步骤的替代方法相比，并不需要对所述血浆或血清进行复杂的处理。利用基于聚合酶链式反应(PCR)的技术，通过检测母体血浆或者血清中的胎儿DNA来实现恒河猴胎儿D(RhD)基因型的检测(Loetal.,N.Engl.J.Med.339:1734-1738,1998)、胎儿性别的确定(Costaetal.,N.Engl.J.Med.346:1502,1998)以及数种胎儿病症的诊断(Amicuccietal.,Clin.Chem.46:301-302,2000；Saitoetal.,Lancet356:1170,2000；及Chiuetal.,Lancet360:998-1000,2002)。此外，已报道在先兆子痫(Loetal.,Clin.Chem.45:184-188,1999和Zhongetal.,Am.J.Obstet.Gynecol.184:414-419,2001)、胎儿21三体(Loetal.,Clin.Chem.45:1747-1751,1999和Zhongetal.Prenat.Diagn.20:795-798,2000)和妊娠剧吐症(hyperemesisgravidarum)(Sekizawaetal.,Clin.Chem.47:2164-2165,2001)中的母体血浆/血清的胎儿DNA定量性异常。美国专利第6,258,540号也公开了用于产前遗传分析的母体血液中胎儿核酸的检测。母体血液中的胎儿RNA已经被确定作为妊娠相关状态的诊断工具。例如，美国专利申请号09/876,005公开了基于检测母体血液中胎儿RNA的非侵入性技术；美国专利申请号10/759,783还公开了母体血液中存在的某些mRNA种类(例如，hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2和PLAC1)的数量可以用作诊断、监测或者预测妊娠相关病症的标志物，所述妊娠相关状态例如先兆子痫、胎儿染色体的非整倍性和早产。尽管DNA的稳定性为基于胎儿DNA的诊断提供了优势，但是这种方法存在较大的限制：胎儿和母体DNA均存在于孕妇血液的无细胞部分，例如，血清或者血浆。因此，需要区分胎儿DNA和母体DNA以保证确切的诊断。公开号为20030044388的美国专利申请号09/944,951首次公开了胎儿和母体DNA可以根据它们不同的甲基化模式进行区分。Landes等在美国专利申请公开号20030211522中还提出了不同的甲基化标志物可以用于产前诊断。在本文中，许多位于染色体21上的人类基因组DNA序列第一次被鉴定为包含基因组DNA差别甲基化区域的位点，所述基因组DNA来自胎儿或者成人(例如，孕妇)。因此，这些差别甲基化的基因组位点能够正确鉴定或者定量胎儿和母体DNA，从而能够可靠的诊断产前状态。专利技术简述在本专利技术的第一个方面，提供检测或者监测在怀有胎儿的妇女中的妊娠相关病症的方法。所述方法包括下列步骤：(a)从所述妇女获得生物样品，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(b)确定样品中包含CpG的基因组序列的甲基化状态，其中所述胎儿的基因组序列和所述妇女的基因组序列是差别甲基化的，从而区别所述样品中所述妇女的基因组序列和所述胎儿的基因组序列，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的DNA序列组成，所述基因组位点选自CGI137、磷酸二酯酶9A(PDE9A)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(PPP1R2P2)、类Fem1A(秀丽线虫(Caenorhabditiselegans))、CGI009、羰基还原酶1(CBR1)、唐氏综合症细胞粘附分子(DSCAM)、染色体21开放阅读框29(C21orf29)、羧化全酶合成酶(HLCS)和CGI132；(c)确定胎儿基因组序列的水平；和(d)将所述胎儿基因组序列的水平与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。在一些实施方式中，所述妇女的基因组序列是甲基化的，而胎儿的基因组序列是非甲基化的。在其他实施方式中，所述妇女的基因组序列是非甲基化的，而胎儿的基因组序列是甲基化的。在一些实施方式中，通过用差别修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂处理样品来实施步骤(b)。例如，所述试剂可以包括亚硫酸氢盐；或者所述试剂可以包括一种或者多种优选切割甲基化DNA的酶；或者所述试剂可以包括一种或者多种优选切割非甲基化DNA的酶。在一些实施方式中，通过甲基化特异性PCR来实施步骤(b)。在本专利技术的第二个方面，提供检测或者监测在怀有胎儿的妇女中的妊娠相关病症的方法。所述方法包括以下步骤：(a)从所述妇女的生物样品获得DNA，其中所述样品是全血、血清、血浆、尿液或者唾液；(b)用亚硫酸氢盐处理步骤(a)的DNA；和(c)利用步骤(b)的DNA和两条引物进行扩增反应来扩增包含CpG的基因组序列，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的DNA序列组成，所述基因组位点选自：CGI137、磷酸二酯酶9A(PDE9A)、智人蛋白磷酸酶1、调节(抑制剂)亚基2假基因2(PPP1R2P2)、类Fem1A(秀丽线虫)、CGI009、羰基还原酶1(CBR1)、唐氏综合症细胞粘附分子(DSCAM)、染色体21开放阅读框29(C21orf29)、羧化全酶合成酶(HLCS)和CGI132；和其中两条引物中的至少一条与胎儿基因组序列差别结合；和(d)将从步骤(c)扩增的基因组序列的部分的水平与标准对照进行比较，其中相对于标准对照的增加或者降低提示妊娠相关病症的存在或者进展。在一些实施方式中，扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)，例如甲基化特异性PCR。在其他实施方式中，扩增反应是基于核酸序列的扩增、链置换反应或者分枝DNA扩增反应。该方法以及本专利技术第一个方面描述的方法，适合于检测或者监测状态，本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测和监测妊娠相关病症的试剂盒，包括：差别修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂(a)，所述试剂用于处理从怀有胎儿的妇女的生物样品获得的DNA，其中所述样品是全血、血清、或血浆；用于进行引物延伸、多核苷酸杂交、实时PCR或电泳的试剂(b)，其确定经所述试剂(a)处理后的生物样品中包含甲基化CpG的基因组序列的量，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的DNA序列组成，所述基因组位点选自：CGI137、磷酸二酯酶9A、智人蛋白磷酸酶1、调节抑制剂亚基2假基因2、类秀丽线虫Fem1A、CGI009、羰基还原酶1、唐氏综合症细胞粘附分子、染色体21开放阅读框29、羧化全酶合成酶和CGI132；和标准对照(c)，其指示来自没有任何妊娠相关病症的健康孕妇的相同类型的生物样品中包含甲基化CpG的基因组序列的量。

【技术特征摘要】
2006.05.03 US 60/797,456;2007.04.06 US 11/784,4991.用于检测和监测妊娠相关病症的试剂盒，包括：差别修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂(a)，所述试剂用于处理从怀有胎儿的妇女的生物样品获得的DNA，其中所述样品是全血、血清、或血浆；用于进行引物延伸、多核苷酸杂交、实时PCR或电泳的试剂(b)，其确定经所述试剂(a)处理后的生物样品中包含甲基化CpG的基因组序列的量，其中所述基因组序列至少长15个核苷酸，包括至少一个胞嘧啶，并且位于染色体21的区域内，而且其中所述区域由(1)基因组位点和(2)不超过所述位点上游和/或下游10kb的DNA序列组成，所述基因组位点选自：CGI137、磷酸二酯酶9A、智人蛋白磷酸酶1、调节抑制剂亚基2假基因2、类秀丽线虫Fem1A、CGI009、羰基还原酶1、唐氏综合症细胞粘附分子、染色体21开放阅读框29、羧化全酶合成酶和CGI132；和标准对照(c)，其指示来自没有任何妊娠相关病症的健康孕妇的相同类型的生物样品中包含甲基化CpG的基因组序列的量。2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂(a)包括一种或者多种优选切割甲基化DNA的酶。3.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂(a)包括一种或者多种优选切割非甲基化DNA的酶。4.如权利要求1所述的试剂盒，还包括两条引物，所述引物用于扩增所述基因组序列。5.如权利要求1所述的试剂盒，还包括用于扩增所述甲基化或者非甲基化基因组序列的引物。6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其中所述扩增通过PCR进行。7.如权利要求4或5所述的试剂盒，其中所述扩增通过甲基化特异性PCR进行。8.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂(b)用于引物延伸。9.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂(b)用于多核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢煜明，赵慧君，詹兆冲，丁春明，金胜男，李婉娴，伦妙芬，
申请(专利权)人：香港中文大学，
类型：发明
国别省市：中国香港,81