一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，包括：(1)制备RGD‑PEG‑COOH；(2)制备PEI‑DTPA；(3)制备PEI‑DTPA‑mPEG；(4)制备PEI‑DTPA‑mPEG‑(PEG‑RGD)；(5)制备RGD‑Au PENPs；(6)制备RGD‑

Preparation method of hyperbranched polyethyleneimine nano probe based on RGD peptide modification

The invention relates to a method for preparing RGD peptide modified hyperbranched polyethyleneimine based on nano probes include: (1) preparation of RGD PEG COOH; (2) preparation of PEI DTPA; (3) preparation of PEI DTPA mPEG; (4) preparation of PEI DTPA mPEG (PEG RGD); (5) preparation of RGD Au PENPs; (6) preparation of RGD

【技术实现步骤摘要】
一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法
本专利技术属于纳米造影剂领域，特别涉及一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法。
技术介绍
ComputerTomography(CT)成像技术具有较高的空间分辨率，较短的图像采集时间，并能提供高分辨的3D断层信息，但是自身存在软组织分辨率差、较高的放射性辐射等缺陷。PositionEmissionTomography(PET)和Single-PhotonEmissionComputedTomography(SPECT)成像可获得肿瘤部位的生理生化信息，但是对于肿瘤部位的解剖信息很难获得较高的分辨率。鉴于每种成像模式都有其自身不足之处，单一的成像模式已经不能满足对疾病精准诊断的需要。因此，结合两种或者两种以上的成像模式，实现功能成像(PET或者SPECT)与结构成像(CT或者MagneticResonanceImaging(MRI))的有机结合是目前疾病诊断的发展趋势之一。发展一种新型的、多功能的SPECT/CT双模态成像造影剂，可以结合CT和SPECT两种成像技术各自的优点从而提高疾病诊断的准确度，同时可以克服传统医用CT或SPECT成像造影剂的缺陷，如成像时间短、存在肾脏毒性等。这对于疾病的诊断尤其是癌症的早期诊断具有重大意义，它一方面减少造影剂对病患的毒副作用，另一方面可以提供更加全面而清晰的诊断信息。超支化聚乙烯亚胺(PEI)是一种分子量较大的支链状PEI，内部有疏水的空腔，可以用来稳定金属或金属氧化物、药物分子等(Sunetal.,Chem.Commun.2011,47(13),3817-3819)。PEI表面富有氨基为材料的功能化修饰提供了可能。Zhou等用聚乙二醇化的PEI包裹AuNPs用于血池和肿瘤CT成像(B.Zhouetal.,ACSAppl.Mater.Interfaces2014,6,17190-17199)。Li等用外围包裹AuNPs的聚乙二醇化的PEI稳定Fe3O4纳米颗粒用于CT/MR双模态成像(J.Lietal.,ACSAppl.Mater.Interfaces2013,5,10357-10366)。Li等还发现了用透明质酸修饰的表面含有金星的PEI稳定的Fe3O4纳米颗粒用于CT成像、MR成像和光热治疗(J.Lietal.，Biomaterials2015,38,10-21)。检索国内外有关SPECT/CT双模态成像造影剂方面的文献和专利结果表明：目前，还没有发现基于超支化聚乙烯亚胺分子的SPECT/CT双模态成像纳米探针的制备与肿瘤诊断应用方面的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，该方法制备过程简单，实验条件为常温常压；采用价廉易得的聚乙烯亚胺分子为载体，降低了材料的成本，所制备得到的SPECT/CT双模态纳米探针具有良好的生物相容性，对原位肝癌具有良好的靶向SPECT和CT成像效果，为发展新型的、廉价的多功能纳米造影剂开辟了新的思路。本专利技术的一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，包括：(1)在一端氨基、另一端羧基的聚乙二醇NH2-PEG-COOH溶液中加入6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯溶液中反应8-12h，再把RGD多肽溶液逐滴加入已活化的NH2-PEG-COOH中，搅拌反应2-4d，透析，冷冻干燥，即得RGD-PEG-COOH；(2)在PEI溶液中逐滴加入二乙烯五乙酸盐DTPA溶液，搅拌反应20-30h，冷冻干燥，即得PEI-DTPA；(3)在羧基化聚乙二醇单甲醚mPEG-COOH溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl溶液，室温搅拌15-30min，然后加入N-羟基丁二酰亚胺NHS溶液继续搅拌2-3h，得到混合溶液；随后将混合溶液逐滴加入PEI-DTPA溶液中，搅拌反应2-4d，透析，冷冻干燥，即得PEI-DTPA-mPEG；(4)在RGD-PEG-COOH溶液中加入EDC·HCl溶液，室温搅拌15-30min，然后加入NHS溶液继续搅拌2-3h，得到混合溶液；将混合溶液逐滴加入PEI-DTPA-mPEG溶液中，搅拌反应2-4d，溶液，透析，冷冻干燥，得到RGD靶向的功能化聚乙烯亚胺分子，标记为PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)；(5)在PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)水溶液中加入HAuCl4溶液搅拌15-30min，再加入NaBH4溶液，继续搅拌2-4h；然后加入三乙胺N(C2H5)3搅拌20-40min，再加入乙酸酐Ac2O搅拌反应20-30h，透析，冷冻干燥，即得RGD多肽修饰的金纳米颗粒，标记为RGD-AuPENPs；(6)将RGD-AuPENPs溶液中加入SnCl2溶液搅拌5-10min，然后再加入无菌放射性高鍀酸盐溶液并混合反应5-10min，纯化分离，得到螯合核素99mTc的金纳米颗粒，标记为RGD-99mTc@AuPENPs，即为RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针。所述步骤(1)中的RGD与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1:1；6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1:1；RGD的分子量为706.67g/mol，浓度为4-6mg/mL，6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的浓度为6-10mg/mL，NH2-PEG-COOH的分子量为2000g/mol，浓度为3-5mg/mL。所述步骤(1)中的透析膜为纤维素透析膜，截留分子量MWCO为1000，先在PBS中透析1d，再在去离子水中透析2d。所述步骤(2)中的DTPA与PEI的摩尔比为10:1；DTPA的分子量为357.32g/mol，DTPA溶液的浓度为20-30mg/mL，PEI的浓度为3-5mg/mL。所述步骤(3)中的EDC·HCl与mPEG-COOH的摩尔比为10:1，NHS与mPEG–COOH的摩尔比为10:1，mPEG-COOH与PEI-DTPA的摩尔比为20:1；mPEG-COOH的分子量为2000g/mol，mPEG-COOH溶液的浓度为3-5mg/mL，EDC溶液的浓度为5-8mg/mL，NHS溶液的浓度为3-6mg/mL，PEI-DTPA溶液的浓度为2-4mg/mL。所述步骤(4)中的EDC·HCl与RGD-PEG-COOH的摩尔比为10:1，NHS与RGD-PEG-COOH的摩尔比为10:1，RGD-PEG-COOH与PEI-DTPA-mPEG的摩尔比为10:1；RGD-PEG-COOH溶液的浓度为3-5mg/mL，EDC溶液的浓度为5-8mg/mL，NHS溶液的浓度为3-6mg/mL，PEI-DTPA-mPEG溶液的浓度为2-4mg/mL。所述步骤(2)-(4)中的透析膜为纤维素透析膜，MWCO为8000-14000，先在PBS中透析1d，再在去离子水中透析2d。所述步骤(5)中的HAuCl4的浓度为5-10mg/mL，NaBH4的浓度为3-6mg/mL，NaBH4溶液的溶剂为冰水。所述步骤(5)中的HAuCl4与PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)的摩尔比为200:1，NaB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，包括：(1)在一端氨基、另一端羧基的聚乙二醇NH2‑PEG‑COOH溶液中加入6‑(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯溶液中反应8‑12h，再把RGD多肽溶液逐滴加入已活化的NH2‑PEG‑COOH中，搅拌反应2‑4d，透析，冷冻干燥，即得RGD‑PEG‑COOH；(2)在PEI溶液中逐滴加入二乙烯五乙酸盐DTPA溶液，搅拌反应20‑30h透析，冷冻干燥，即得PEI‑DTPA；(3)在羧基化聚乙二醇单甲醚mPEG‑COOH溶液中加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl溶液，室温搅拌15‑30min，然后加入N‑羟基丁二酰亚胺NHS溶液继续搅拌2‑3h，得到混合溶液；随后将混合溶液逐滴加入PEI‑DTPA溶液中，搅拌反应2‑4d，透析，冷冻干燥，即得PEI‑DTPA‑mPEG；(4)在RGD‑PEG‑COOH溶液中加入EDC·HCl溶液，室温搅拌15‑30min，然后加入NHS溶液继续搅拌2‑3h，得到混合溶液；将混合溶液逐滴加入PEI‑DTPA‑mPEG溶液中，搅拌反应2‑4d，溶液，透析，冷冻干燥，得到RGD靶向的功能化聚乙烯亚胺分子，标记为PEI‑DTPA‑mPEG‑(PEG‑RGD)；(5)在PEI‑DTPA‑mPEG‑(PEG‑RGD)水溶液中加入HAuCl4溶液搅拌15‑30min，再加入NaBH4溶液，继续搅拌2‑4h；然后加入三乙胺N(C2H5)3搅拌20‑40min，再加入乙酸酐Ac2O搅拌反应20‑30h，透析，冷冻干燥，即得RGD多肽修饰的金纳米颗粒，标记为RGD‑Au PENPs；(6)将RGD‑Au PENPs溶液中加入SnCl2溶液搅拌5‑10min，然后再加入无菌放射性高鍀酸盐溶液并混合反应5‑10min，纯化分离，得到螯合核素...

【技术特征摘要】
1.一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，包括：(1)在一端氨基、另一端羧基的聚乙二醇NH2-PEG-COOH溶液中加入6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯溶液中反应8-12h，再把RGD多肽溶液逐滴加入已活化的NH2-PEG-COOH中，搅拌反应2-4d，透析，冷冻干燥，即得RGD-PEG-COOH；(2)在PEI溶液中逐滴加入二乙烯五乙酸盐DTPA溶液，搅拌反应20-30h透析，冷冻干燥，即得PEI-DTPA；(3)在羧基化聚乙二醇单甲醚mPEG-COOH溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl溶液，室温搅拌15-30min，然后加入N-羟基丁二酰亚胺NHS溶液继续搅拌2-3h，得到混合溶液；随后将混合溶液逐滴加入PEI-DTPA溶液中，搅拌反应2-4d，透析，冷冻干燥，即得PEI-DTPA-mPEG；(4)在RGD-PEG-COOH溶液中加入EDC·HCl溶液，室温搅拌15-30min，然后加入NHS溶液继续搅拌2-3h，得到混合溶液；将混合溶液逐滴加入PEI-DTPA-mPEG溶液中，搅拌反应2-4d，溶液，透析，冷冻干燥，得到RGD靶向的功能化聚乙烯亚胺分子，标记为PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)；(5)在PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)水溶液中加入HAuCl4溶液搅拌15-30min，再加入NaBH4溶液，继续搅拌2-4h；然后加入三乙胺N(C2H5)3搅拌20-40min，再加入乙酸酐Ac2O搅拌反应20-30h，透析，冷冻干燥，即得RGD多肽修饰的金纳米颗粒，标记为RGD-AuPENPs；(6)将RGD-AuPENPs溶液中加入SnCl2溶液搅拌5-10min，然后再加入无菌放射性高鍀酸盐溶液并混合反应5-10min，纯化分离，得到螯合核素99mTc的金纳米颗粒，标记为RGD-99mTc@AuPENPs，即为RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针。2.根据权利要求1所述的一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的RGD与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1:1；6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1:1；RGD的分子量为706.67g/mol，浓度为4-6mg/mL，6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的浓度为6-10mg/mL，NH2-PEG-COOH的分子量为2000g/mol，浓度为3-5mg/mL。3.根据权利要求1所述的一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的DTPA与PEI...

【专利技术属性】
技术研发人员：史向阳，周本青，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：上海,31