用于神经逆向示踪的CTB‑AuNDs复合物、制备方法及其应用技术

一种用于神经逆向示踪的CTB‑AuNDs复合物、制备方法及其在神经逆向示踪方面的应用，属于荧光金纳米材料技术领域。本发明专利技术首先制备用于神经逆向示踪的红色荧光金纳米点，其具有高荧光效率，高稳定性和低毒性；进一步将红色荧光Au纳米点与无细胞毒性的霍乱毒素B亚基(CTB)相连接，形成CTB‑AuNDs复合物。CTB‑AuNDs复合物产物具有荧光效率高、稳定性优良，表现出良好的光学性质和水溶性，特别是具有靶向神经的功能。将这种复合物注射入大鼠的坐骨神经处，其能够靶向性地与神经细胞的细胞膜发生特异性结合，并沿着细胞膜逆向传输，并且金纳米点的荧光性质可在大鼠体内神经部位长时间保持。这种兼具高稳定性、特异性结合细胞膜的CTB‑AuNDs，可以作为一种逆向神经示踪剂，用于示踪神经细胞。

For CTB AuNDs, complex neural tracer reverse preparation method and application thereof

For a neural tracer CTB AuNDs reverse compound, preparation method and application thereof to reverse the neural tracer, which belongs to the technical field of fluorescent gold nanoparticles. The invention firstly for the preparation of red fluorescent gold nanoparticles reverse neural tracer, which has a high fluorescence efficiency, high stability and low toxicity; further red fluorescent nano Au and cholera toxin B non cytotoxic subunit (CTB) is connected with the formation of CTB AuNDs complex. CTB AuNDs composite products with high fluorescence efficiency, excellent stability, exhibit optical properties and good water solubility, especially targeting nerve function. This compound was injected into the sciatic nerve at the rat, capable of targeting the cell membrane of nerve cell specific binding and reverse transmission along the cell membrane, and the fluorescence properties of gold nanoparticles can be maintained in the in vivo rat nerve long time. It has high stability and specificity of membrane bound CTB AuNDs, can be used as a reverse neural tracer, tracer for nerve cells.

【技术实现步骤摘要】
用于神经逆向示踪的CTB-AuNDs复合物、制备方法及其应用
本专利技术属于荧光金纳米材料
，具体涉及一种用于神经逆向示踪的CTB-AuNDs复合物、制备方法及其在神经逆向示踪方面的应用。
技术介绍
金属纳米点(NDs)作为一种尺寸接近于费米波长的粒子而展现出的新颖光学、电学、磁学等性质，成为已报道的众多荧光纳米材料中不可或缺的组成部分(Chem.Soc.Rev.，2012，41，3594-3623)。其中荧光Au纳米点可调的荧光、良好的生物相容性，特别是优异的荧光稳定性，使其可以广泛应用于诸如生物传感、癌症治疗、生物体成像等生物医药领域(Small.，2013，9，413-420)。神经系统在人体生命活动中起着主导的调节作用。神经示踪技术是神经解剖学和神经再生研究中最常用的方法之一，与其他已报道的检测手段相比，该方法可更直观地检测出神经损伤部位，准确地反应神经再生水平和神经功能恢复的程度。由于传统神经示踪剂合成过程复杂、检测耗时长、荧光信号弱以及荧光稳定性低等原因，限制了其在临床诊断中的应用(Science，1972，176，1416-1417)。所以急需开发一种合成过程简单、检测耗时短、荧光量子效率高且稳定性强的新型神经示踪剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于神经逆向示踪的CTB-AuNDs复合物、制备方法及其在神经逆向示踪方面的应用。本专利技术首先制备用于神经逆向示踪的红色荧光金纳米点具有高荧光效率，高稳定性和低毒性；进一步将红色荧光Au纳米点与无细胞毒性的霍乱毒素B亚基(CTB)相连接，形成CTB-AuNDs复合物。将这种复合物注射入大鼠的坐骨神经处，其能够靶向性地与神经细胞的细胞膜发生特异性结合，并沿着细胞膜逆向传输，并且金纳米点的荧光性质可在大鼠体内神经部位长时间保持。这种兼具高稳定性、特异性结合细胞膜的CTB-AuNDs，可以作为一种逆向神经示踪剂，用于示踪神经细胞。制备的荧光Au纳米点粒径均匀且尺寸小于3nm(图1)，具有良好的红色荧光(图2)。将荧光Au纳米点与CTB相连，形成CTB-AuNDs复合物。将其注射入大鼠背根神经节后，该CTB-AuNDs复合物可以沿着大鼠背根神经节逆向传输，最后到达脊髓部位(图3)。这种兼具有荧光效率高、荧光稳定性好的CTB-AuNDs可以作为一种逆行传输的荧光神经示踪剂应用于神经示踪领域。本专利技术所述的一种用于神经逆向示踪的红色荧光金纳米点的制备方法，其步骤如下所述：1)在浓度为0.1～500mmol/L(优选为0.1～100mmol/L，进一步优选为10～100mmol/L)的含有巯基的水溶性化合物(可以是谷胱甘肽，含巯基的氨基酸，含巯基的蛋白等)作稳定剂的水溶液中，加入与含有巯基的水溶性化合物等摩尔的Ag+离子溶液(可以是AgNO3、CH3COOAg、AgF、Ag2SO4、AgClO4等的水溶液)，常温搅拌10～30min后，加入1mol/LNaOH溶液，调节pH至5～8(优选为6～7)，至溶液无色透明；再向上述溶液中加入水合肼作为还原剂，水合肼(N2H4·H2O)与Ag+离子的摩尔比为1～10：1；然后在常温下搅拌12h～48h(优选为24h～48h，进一步优选为36h～48h)，反应结束后，向溶液中加入异丙醇(其体积为溶液体积的2～20倍)作为沉淀剂，沉淀离心后得到的固体产物即为Ag纳米点，将Ag纳米点分散在水溶液中(总体积为1～50mL)，备用；2)应用电化学交换反应，以银纳米点为模板，用金离子刻蚀银纳米点，形成金纳米点：在浓度为10～500mmol/L(优选为50～500mmol/L，进一步优选为50～100mol/L)的Ag纳米点水溶液中加入浓度为10～500mmol/L(优选为50～500mmol/L，进一步优选为50～100mmol/L)的含有Au3+的溶液(可以是HAuCl4，AuCl3等的水溶液)，Ag+与Au3+的摩尔比为1～2：1，加入1mol/LNaOH溶液，调节pH至5～11(优选为6～10，进一步优选为8～10)，然后在60～100℃下搅拌2～8小时(优选为2～6小时，进一步优选为2～4小时)，反应结束后离心，向清液中加入异丙醇(其体积为溶液体积的2～10倍)作为沉淀剂，沉淀离心后得到的固体产物即为红色荧光Au纳米点，将红色荧光Au纳米点分散在水溶液中(总体积为1～20mL)，备用；3)将步骤2)得到的具有高稳定性、高荧光效率的红色荧光Au纳米点与能够特异性结合神经细胞的靶向试剂相连接，制备出一种CTB-AuNDs复合物，即能够特异性结合神经细胞的神经示踪剂：将神经靶向试剂霍乱毒素B亚基(CTB)粉末溶解于含有0.2MNaCl、3mMNaN3、1mMEDTA(乙二胺四乙酸)的Tris缓冲溶液(0.05M，pH＝7.5)中，使其浓度达到0.1～100mg/mL(优选为0.1～10mg/mL，进一步优选为1～10mg/mL)；在4℃环境下，将上述溶液用3500分子量的渗析袋渗析3～5天，以除去溶液中的金属离子；在浓度为0.01～100mg/mL(优选为0.01～10mg/mL，进一步优选为0.1～1mg/mL)的Au纳米点的水溶液中加入浓度为0.1～10mg/mL(优选为0.1～5mg/mL，进一步优选为0.1～1mg/mL)EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)的Tris溶液，Au3+与EDC的摩尔比为10～100：1，以及浓度为0.1～10mg/mL(优选为0.1～5mg/mL，进一步优选为0.1～1mg/mL)NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的Tris溶液，Au3+与NHS的摩尔比为10～100：1，搅拌30～50min；最后加入上述含有神经靶向试剂的溶液，神经靶向试剂霍乱毒素B亚基(CTB)与Au纳米点的质量比为0.05～50：1(优选为0.5～20：1，进一步优选为1～10：1)，在摇床上室温反应4h～24h(优选为4h～12h，进一步优选为8h～12h)；将所得产物用3500分子量的渗析袋在4℃下渗析5～10天，以除去体系中的小分子；将渗析后的溶液冻干，并分散于Tris缓冲液(1～10mL)中，得到CTB-AuNDs复合物，即能够特异性结合神经细胞的神经示踪剂。一种用于神经逆向示踪的CTB-AuNDs复合物，其是由上述方法制备得到。本专利技术所制备的CTB-AuNDs复合物用于靶向示踪神经细胞功能具有以下优点：CTB-AuNDs复合物产物荧光效率高，稳定性优良，表现出良好的光学性质和水溶性，特别是具有靶向神经的功能。将之注射入大鼠的背根神经节，可沿着神经逆向传输至脊髓处，其具有红色荧光(发射波长为607nm)，避免了肌体自发荧光的干扰，生物毒性低，生物相容性好。另外这种制备方法易于操作，条件温和，重复性好，适合大量生产。附图说明图1：实施例1所制备的荧光Au纳米点TEM图，其平均粒径尺寸为2.5nm左右，图1中插图为Au纳米点的高分辨透射电镜照片，显示Au纳米点的晶格间距为图2：实施例1所制备的荧光Au纳米点的荧光光谱图，光谱表明Au纳米点的最佳激发波长为415nm，最佳发射波长为604nm，图2中插图为光学照片，显示Au纳米点的水溶液为淡黄色，且在水中分散性较好，在紫外灯照射下，显示明本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于神经逆向示踪的CTB‑AuNDs复合物的制备方法，其步骤如下：1)在浓度为0.1～500mmol/L的含有巯基的水溶性化合物作稳定剂的水溶液中，加入与含有巯基的水溶性化合物等摩尔的Ag

【技术特征摘要】
1.一种用于神经逆向示踪的CTB-AuNDs复合物的制备方法，其步骤如下：1)在浓度为0.1～500mmol/L的含有巯基的水溶性化合物作稳定剂的水溶液中，加入与含有巯基的水溶性化合物等摩尔的Ag+离子的水溶液，常温搅拌10～30min后，加入1mol/LNaOH溶液，调节pH至5～8，至溶液无色透明；再向上述溶液中加入水合肼作为还原剂，水合肼与Ag+离子的摩尔比为1～10：1；然后在常温下搅拌12h～48h，反应结束后，向溶液中加入异丙醇作为沉淀剂，沉淀离心后得到的固体产物即为Ag纳米点，然后将Ag纳米点分散在水溶液中；2)在浓度为10～500mmol/L的Ag纳米点水溶液中加入浓度为10～500mmol/L的Au3+的水溶液，Ag+与Au3+的摩尔比为1～2：1；再加入1mol/LNaOH溶液，调节pH至5～11，然后在60～100℃下搅拌2～8小时，反应结束后离心，向清液中加入异丙醇作为沉淀剂，沉淀离心后得到的固体产物即为红色荧光Au纳米点，将Au纳米点分散在水溶液中；3)将神经靶向试剂霍乱毒素B亚基粉末溶解于含有0.2MNaCl、3mMNaN3、1mMEDTA的Tris缓冲溶液中，使其浓度达到0.1～100mg/mL；在4℃环境下，将上述溶液用3500分子量的渗析袋渗析3～5天，以除去溶液中的金属离子；在浓度为0.01～100mg/mL的红色荧光Au纳米点溶液中加入浓度为0.1～10mg/mLEDC的Tris溶液，以及浓度为0.1～10mg/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：林权，赵玥琪，孙源卿，赵天鑫，宋善良，杨柏，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22