一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法技术

本发明专利技术提供了一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：(1)组织处理器械消毒；(2)选取2～3周的雄性SD大鼠，断颈处死，用眼科剪剪去大鼠腿部被毛，截取坐骨神经，将组织放入预冷无菌含双抗的PBS液中洗涤数次除去血渍和外膜；(3)剪碎组织，并用预热的II型胶原酶和IV型胶原酶消化；(4)终止消化，离心，弃上清，加培养基重悬；(5)组织块贴壁法接种到6孔培养板培养；(6)孵育1～2h，置于37℃、5％CO2环境中培养；(7)细胞传代纯化；(8)细胞形态学观察与鉴定。本发明专利技术提供的一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法，简单易操作，稳定，高效，获得的施旺细胞活力高，可用于建立体外实验模型细胞，满足大鼠施旺细胞实验的要求。

A method for isolation and culture of Schwann cells in rats

The invention provides a rat Schwann cell isolation and culture method, which comprises the following steps: (1) the tissue processor disinfection; (2) male SD rats were selected from 2 to 3 weeks, were sacrificed, cut rat leg hair cut by eye, interception of sciatic nerve tissue in the pre cooling with sterile double anti PBS solution is washed several times to remove blood stains and adventitia; (3) the shear organization, and preheating type II collagenase IV and collagenase; (4) the termination of digestion, centrifugation, Kami Kiyo, with medium weight hanging; (5) the explant inoculated into the 6 Hole culture plate; (6) were incubated for 1 ~ 2H, at 37 C and 5%CO2 training environment; (7) cell passage purification; (8) the observation and identification of cell morphology. The invention provides a rat Schwann cell isolation and culture method, simple and easy to operate, stable, efficient, the Schwann cell activity is high, can be used to establish the experimental model in vitro, rat Schwann cells to meet the experimental requirements.

【技术实现步骤摘要】
一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法
本专利技术属于现代生物技术之细胞培养
，具体涉及一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法。
技术介绍
施旺细胞(SchwanncellsSCs)是周围神经系统特有的、最主要的胶质细胞，在周围神经的发生及损伤后的再生中起着重要的作用。它是周围神经纤维的鞘细胞，排列成串，包裹着周围神经纤维的轴突，反复包卷形成的同心圆板层，形成髓鞘。施旺细胞可分泌细胞粘附分子、多种神经营养因子(NTFs)和细胞外基质，促进和引导周围神经轴突的再生。施旺细胞能大量持续分泌生长因子VEGF、TGF、PDGF等各种生物活性物质以及分泌基质。以往研究表明神经和血管相伴行，近来进一步的研究探讨了其中的分子机制。Mukouyama等研究发现小鼠小动脉特异性地与外周感觉神经伴行，外周感觉神经或施旺氏细胞的缺失可以导致小动脉生成障碍。施旺氏细胞在血管的动脉样分化和成熟中具有重要作用。近来发现，VEGF不仅在血管新生中发生着重要作用，还可以减小施旺细胞培养时的应急反应，增加在心肌内的生存率，从而改善心梗后心功能。目前国内外对于大鼠施旺细胞的分离与培养的研究较少，分离方法不成熟，获得的细胞纯度低，数量少。本专利技术旨在提供一种操作简单、高效的获得生长状态好、纯度高的大鼠施旺细胞的方法，建立一套完善可靠的大鼠施旺细胞体外培养技术。
技术实现思路
根据上述问题，本专利技术提供了一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法，该方法操作简单，细胞产量和成活率高，是一种较为理想的大鼠施旺细胞原代培养方法，可以满足多种生理生化实验的要求。本专利技术采用的的技术方案如下：(1)将组织处理器械浸泡于浓度75％乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在无菌操作台里晾干；(2)选取2～3周的雄性SD大鼠，颈椎脱臼法处死，将处死后的大鼠用75％乙醇浸泡10s；(3)将大鼠腹面向上固定于板上，局部常规消毒，用眼科剪剪去大鼠腿部被毛，分离腿部肌肉截取坐骨神经，将组织放入预冷无菌含双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)PBS液(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)中洗涤除去血渍，去除外膜；(4)无菌条件下，在预冷的PBS(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)中用眼科剪将神经组织剪成1mm×1mm的碎块；(5)用37℃预热的II型胶原酶结合IV型胶原酶混合消化；(6)用10ml含10％大鼠血清、双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)、4～6μg/ml胰岛素的DMEM/F12(1∶1)混合培养基(简称混合培养基)终止消化，所得滤液100～200g离心10min，去掉上清液，保留沉淀；(7)组织块贴壁法接种细胞至铺多聚赖氨酸包被的的6孔培养板中；(8)倒置在37℃孵箱中孵育1～2h，沿孔边缓慢加入混合培养基，置于37℃、5％CO2环境中培养；(9)24h小时后加入1ml的3～5μg/ml的阿糖胞苷处置48h，以除去成纤维细胞；(10)接种72h初次换液，换液后同时加入1ml的20～30ng/ml的成纤维细胞生长因子(bFGF)纯化细胞和1ml的4～6μM的福司柯林促进施旺细胞增殖；本专利技术在步骤(10)之后还包括以下步骤：(11)细胞传代纯化细胞：培养7～9天，细胞增殖达到70～80％时进行传代，用PBS(浓度为0.01M，PH为7.2～7.4)清洗2～3次，用0.25％的胰酶消化2～3分钟，用含大鼠血清的DMEM/F12(1∶1)培养基终止消化，350g离心去上清，加入10ml含10％大鼠血清、双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)、5μg/ml胰岛素、pH为7.4的DMEM/F12(1∶1)混合培养基重悬细胞沉淀，按照1∶2比例进行传代培养，记为P1，每个孔板的培养基中加入1ml的20～30ng/ml的成纤维细胞生长因子(bFGF)以除去成纤维细胞；(12)细胞形态学观察与鉴定：施旺细胞爬片的制作，细胞免疫荧光鉴定。其中，步骤(2)所选的大鼠体重100±10g，2～3周雄性SD大鼠。其中，步骤(3)(4)所述的PBS已4℃预冷，PBS浓度为0.01M，PH为7.2～7.4，培养皿置于冰上，是为了使组织处于无菌、低温的环境。其中，步骤(5)所述消化环境为37℃CO2培养箱，消化时间20min，消化酶混合液由0.1％～0.2％的II型胶原酶和0.1％～0.2％的IV型胶原酶混匀制得，所述两种酶混合比例1∶1～1∶1.5。其中，步骤(6)所述培养基为DMEM/F12(1∶1)培养基，含10％大鼠血清，含100u/ml的青霉素、100u/ml的链霉素的双抗，5μg/ml的胰岛素。其中，步骤(7)所述组织块贴壁法是将组织均匀铺在培养皿中。其中，步骤(8)所述加入培养基过程应缓慢，勿使组织块漂起。其中，步骤(9)所述阿糖胞苷浓度为5μg/ml。其中，步骤(10)(11)所述的成纤维细胞生长因子浓度为25ng/ml，福司柯林浓度为5μM。有益效果本专利技术建立了一种简单、高效的分离培养大鼠施旺细胞的方法，所得原代细胞经细胞形态学观察与鉴定：数量多、纯度高、活性好，细胞成活率达95％以上，细胞纯度达96％以上，通过免疫细胞化学等方法检测细胞标记物。本专利技术采用SD大鼠为材料，来源广泛。采用酶消化法和组织块贴壁法相结合的分离方法，与单独的组织块贴壁法相比，其细胞迁出的速度更快，与单独的酶消化法细胞，其细胞纯度更高。本专利技术采用阿糖胞苷、成纤维细胞生长因子、福司柯林等，可以在提高细胞CAMP水平的同时达到抑制成纤维细胞的效果。相对于磁珠分离法等其它方法，其技术更简单易掌握，代价更低。本专利技术采用多聚赖氨酸包被培养板，细胞生长状态好，可满足施旺细胞实验的要求，多聚赖氨酸包被比APES包被制作更简单，更易保存；本方法经济实用，简便易行，有利于建立体外实验模型细胞，研究施旺细胞的特性，为后续的实验提供可靠的细胞资源。附图说明图1培养4d的大鼠施旺细胞图片(100×)图2培养7d大鼠脑施旺细胞免疫荧光图片(100×)图3培养7d大鼠脑施旺细胞核免疫荧光图片(100×)具体实施方式在本专利技术中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合附图和实例对本专利技术进行详细说明，本专利技术的保护内容不限于下述实施例。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。本实验所用的实验仪器与试剂如下：外科手术器械一套，倒置显微镜(XDS-1A，上海)，荧光显微镜(Leica，美国)，恒温孵育箱(Heraeus，美国)，低温离心机(TD24B-WS，上海)，超低温冰箱(中科美菱)，移液枪(Eppendorf，美国)，电子分析天平(Sartorius，美国)，超净工作台(HJ-CJ-1D，上海)，CO2细胞培养箱(SANYOMCO-17AI，日本)。DMEM/F12(1∶1)购于Corning公司，青霉素-链霉素双抗于Gibco购买，大鼠血清购买于Bioind公司，多聚赖氨酸共买于美国Gibco公司，Nephrin抗体、阿糖胞苷购买于美国Sigma，成纤维细胞生长因子(bFGF)购买于美国Peprotech，福司柯林购买于美国Sigma，PBS自制(8.0gNal、0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将组织处理器械浸泡于浓度75％乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在无菌操作台里晾干；(2)选取2～3周的雄性SD大鼠，颈椎脱臼法处死，将处死后的大鼠用75％乙醇浸泡10s；(3)将大鼠腹面向上固定于板上，局部常规消毒，用眼科剪剪去大鼠腿部被毛，分离腿部肌肉截取坐骨神经，将组织放入预冷无菌含双抗的PBS液中洗涤除去血渍，去除外膜；(4)无菌条件下，在预冷的PBS中用眼科剪将神经组织剪成1mm×1mm的碎块；(5)用37℃预热的II型胶原酶结合IV型胶原酶混合消化；(6)用含大鼠血清、双抗、胰岛素的混合培养基(简称混合培养基)终止消化，所得滤液100～200g离心10min，去掉上清液，保留沉淀；(7)组织块贴壁法接种细胞至铺多聚赖氨酸包被的的6孔培养板中；(8)倒置在37℃孵箱中孵育1～2h，沿孔边缓慢加入混合培养基，置于37℃、5％CO2环境中培养；(9)24h小时后加入1ml的3～5μg/ml的阿糖胞苷处置48h，以除去成纤维细胞；(10)接种72h初次换液，换液后同时加入1ml的20～30ng/ml的成纤维细胞生长因子(bFGF)纯化细胞和1ml的4～6μM的福司柯林促进施旺细胞增殖；(11)细胞传代纯化；(12)细胞形态学观察与鉴定：施旺细胞爬片的制作，细胞免疫荧光鉴定。...

【技术特征摘要】
1.一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将组织处理器械浸泡于浓度75％乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在无菌操作台里晾干；(2)选取2～3周的雄性SD大鼠，颈椎脱臼法处死，将处死后的大鼠用75％乙醇浸泡10s；(3)将大鼠腹面向上固定于板上，局部常规消毒，用眼科剪剪去大鼠腿部被毛，分离腿部肌肉截取坐骨神经，将组织放入预冷无菌含双抗的PBS液中洗涤除去血渍，去除外膜；(4)无菌条件下，在预冷的PBS中用眼科剪将神经组织剪成1mm×1mm的碎块；(5)用37℃预热的II型胶原酶结合IV型胶原酶混合消化；(6)用含大鼠血清、双抗、胰岛素的混合培养基(简称混合培养基)终止消化，所得滤液100～200g离心10min，去掉上清液，保留沉淀；(7)组织块贴壁法接种细胞至铺多聚赖氨酸包被的的6孔培养板中；(8)倒置在37℃孵箱中孵育1～2h，沿孔边缓慢加入混合培养基，置于37℃、5％CO2环境中培养；(9)24h小时后加入1ml的3～5μg/ml的阿糖胞苷处置48h，以除去成纤维细胞；(10)接种72h初次换液，换液后同时加入1ml的20～30ng/ml的成纤维细胞生长因子(bFGF)纯化细胞和1ml的4～6μM的福司柯林促进施旺细胞增殖；(11)细胞传代纯化；(12)细胞形态学观察与鉴定：施旺细胞爬片的制作，细胞免疫荧光鉴定。2.根据权利要求1所述的大鼠施旺细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：何刚，张亚洲，蒋敏，齐来俊，
申请(专利权)人：江苏齐氏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32