一种从猪胆汁中合成熊去氧胆酸和牛磺熊去氧胆酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种从猪胆汁中合成熊去氧胆酸与牛磺熊去氧胆酸的方法，所述方法包括有提取混合胆酸、分离混合胆酸、合成熊去氧胆酸以及牛磺熊去氧胆酸。利用猪胆汁为原料，采取酶解、超滤和纳滤的方法进行前端除杂来提取混合胆酸，并对提取的混合胆酸进行分离，然后合成熊去氧胆酸及牛磺熊去氧胆酸。采用本发明专利技术所述方法，其原料广泛易得，牛磺熊去氧胆酸纯度高，具有转化率高，重复性好，成本较低，操作简单，制备工艺简单，环境友好，更适于工业化生产，有利于节约资源和降低能耗，其经济效益及环境效益明显，可推动行业可持续性发展。

A method of synthesis from pig bile ursodeoxycholic acid and tauroursodeoxycholic acid

The invention relates to a method of synthesis from pig bile ursodeoxycholic acid and tauroursodeoxycholic acid, the method includes the extraction of mixed acid, separation of mixed acid, synthesis of ursodeoxycholic acid and tauroursodeoxycholic acid. The use of pig bile as the raw material, by enzymolysis, ultrafiltration and nanofiltration method for front impurity to extract the mixed acid, and mixed acid was extracted, separated, and then the synthesis of ursodeoxycholic acid and tauroursodeoxycholic acid. By adopting the method of the invention, the raw materials are widely available, tauroursodeoxycholic acid with high purity, high conversion rate, good repeatability, low cost, simple operation, simple preparation technology, environmentally friendly, more suitable for industrial production, is conducive to saving resources and reducing energy consumption, its economic benefits and environmental benefits. To promote the sustainable development of the industry.

【技术实现步骤摘要】
一种从猪胆汁中合成熊去氧胆酸和牛磺熊去氧胆酸的方法
本专利技术属于生物医药
，涉及牛磺熊去氧胆酸的制备方法，具体涉及一种从猪胆汁中合成熊去氧胆酸和牛磺熊去氧胆酸的方法。
技术介绍
胆汁是人体或脊椎动物肝细胞连续分泌的产物，是一种具有苦味的粘滞性有色碱性液体，其成分除水以外，主要有胆汁酸、胆盐和胆色素，此外还有少量的胆固醇、脂肪酸、卵磷脂、电解质和蛋白质等。现今较常见的动物胆汁一般为禽类胆汁、猪胆汁、牛胆汁、熊胆汁以及蛇胆汁等等。胆汁酸是胆汁的主要成分，约占胆汁总量的50～70%，胆汁的生理作用主要就是由胆汁酸来发挥，在作为药物时，胆汁酸可以用来解热、镇痉镇咳、调节血压、强心利胆、抑菌抗炎以及调节免疫等，且活性较强、副作用又小、价格低廉，因此受到广大用药者的欢迎。在各种动物胆汁中，猪胆汁是最常见且产量最大的，自古代开始就被广泛应用于临床，如用猪胆汁治疗急性黄疸型传染性肝炎、百日咳、急性肠炎以及胃溃疡等，均能收到良好的治疗效果。猪胆汁中主要含胆汁酸类、胆色素、粘蛋白、脂类及无机物等，胆汁酸则主要包含猪去氧胆酸、猪胆酸、鹅去氧胆酸、3α-羟基-6-氧-5α-胆烷酸以及胆石酸等。其中猪去氧胆酸约占40%，鹅去氧胆酸约占25%。熊去氧胆酸(Ursodeoxycgolicacid)简称UDCA，是熊胆的主要成分，其化学名称为(3α，7β)-二羟基-5β胆烷酸，是鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholicacid)的7-羟基差向异构体。自从20世纪80年代，专利技术熊去氧胆酸具有有效溶解胆固醇性结石作用以来，不断有新的研究显示熊去氧胆酸在利胆、护肝中具有积极的作用。近年来，国外报道了UDCA不仅对治疗原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、慢性活动性肝炎具有良好疗效，还可用与治疗慢性肝炎和肝移植后排斥反应。目前，在临床上熊去氧胆酸主要应用于治疗各种肝胆、消化道疾病。随着分子生物学、以及熊去氧胆酸基础和临床研究的不断进步，人们发现熊去氧胆酸在促进免疫调节、治疗冠心病等方面也有积极作用。因此，随着研究的深入，熊去氧胆酸的利用价值越来越被认识和受到人们的重视，对熊去氧胆酸的需求量也在逐年升高。但是，天然熊胆的来源日益减少。人们一直在努力寻求除以天然熊胆获取熊去氧胆酸之外的替代方法。早期，熊去氧胆酸是通过从牛、羊胆汁中分离提取的胆酸为起始原料，然后经过复杂的化学方法生产的。其中，制成鹅去氧胆酸后需经氧化还原生成熊去氧胆酸。但是，这一方法步骤多、生产时间长、成本高。上世纪80年代后，酶学、微生物发酵方法发展起来。用酶学、微生物发酵方法将鹅去氧胆酸异构化，或通过石胆酸-羟基化生产熊去氧胆酸，但是，这种方法仍然具有步骤多、生产时间长、成本高的缺陷。牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholicacid)化学名为2-[[(3α，5β，7β)-3，7-二羟基-24-氧代胆甾烷-24-基]氨基]乙烷磺酸二水合物，1902年自熊胆中发现，其为熊胆中主要胆汁酸，具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用。临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等。牛磺熊去氧胆酸可增加胆汁酸的分泌，导致胆汁酸成分的变化，使其在胆汁中含量增加。牛磺熊去氧胆酸还可以抑制肝脏胆固醇的合成，降低胆汁中胆固醇及胆固醇酯的量和胆固醇的饱和指数，从而有利于胆汁中胆固醇逐渐溶解。然而天然的熊胆汁资源极其珍贵，即使人工养殖引流熊胆汁，也远远解决不了市场对于熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸越来越大量的需求，为此生物技术合成熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸的工艺应运而生。特别是从来源广泛的猪胆汁中提取鹅去氧胆酸后再化学合成熊去氧胆酸，可以创造明显的经济效益和社会价值。无论是以任何动物源的胆酸、去氧胆酸为原料，还是以甾体化合物（胆固醇、甾醇、黄体酮）为原料，均需合成为鹅去氧胆酸中间体，而且步骤繁多、时间较长、成本较高，为此具有经济意义的技术是以鹅去氧胆酸为原料合成熊去氧胆酸，再合成牛磺熊去氧胆酸。如专利CN102453071A报道了从猪胆膏或下脚料中直接提取合成鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸的制备方法，其存在的问题是：猪去氧胆酸没有提取，而其性质与鹅去氧胆酸相似，为此不仅降低了附加值，而且增加了后续反应的空间位阻效应；溴水氧化反应强烈，难以控制，副反应较多，如过氧化物3,7-二酮基石胆酸，如是降低了转化率，增加了杂质；由于金属钠与钾则属于活泼性金属，所以加氢反应强烈，不但难以控制，而且具有安全隐患，必须石蜡或者煤油中保存；纯化环节不足，仅靠一步酸化沉淀无法脱除猪去氧胆酸、未完全反应的鹅去氧胆酸、过反应的3,7-二酮基石胆酸衍生物等杂质。如专利CN102477059A报道了一种高纯度牛磺熊去氧胆酸及其制备方法，其存在的问题是：合成的混合酸酐不稳定，遇水易分解，遇热易消旋，因而转化率较低，而且低温反应条件难以控制；同时所用原料中的三乙胺、氯甲酸乙酯具有一定毒性，其残留易吸附、包埋在粗结晶中，因为不溶于水，所以难以水洗脱除。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有技术的不足，为人们提供一种以猪胆汁为原料合成熊去氧胆酸与牛磺熊去氧胆酸的方法，利用猪胆汁为原料，采取酶解、超滤和纳滤的方法进行前端除杂来提取混合胆酸，并对提取的混合胆酸进行分离，然后合成熊去氧胆酸及牛磺熊去氧胆酸。该方法提取工艺简单，原料来源广泛易得，对环境污染小，产品纯度高。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种从猪胆汁中合成熊去氧胆酸与牛磺熊去氧胆酸的方法，包括有提取混合胆酸、分离混合胆酸、合成熊去氧胆酸以及牛磺熊去氧胆酸，以猪胆汁为原料，采取酶解、超滤和纳滤的方法进行前端除杂来提取混合胆酸，并对提取的混合胆酸进行分离，然后合成熊去氧胆酸及牛磺熊去氧胆酸，具体包括以下步骤：(1)提取混合胆酸:首先将猪胆酸干粉加入量纯水和复合蛋白酶进行控温酶解得酶解液；酶解液加入沉淀剂后进行离心过滤后，收取澄清液；澄清液经过超滤和纳滤后，并在收取的浓缩液中加入脱色剂进行脱色后，对所得的脱色液进行酸化处理，再进行离心处理收取沉淀物；最后将沉淀物经过甲酯化处理后，收取脱溶物经水洗后即得所述混合胆酸；(2)分离混合胆酸：将步骤(1)中所得的混合胆酸先加入甲醇使之酸化形成混合胆酸甲脂，经过脱醇后得甲酯混合物再通过酯化与结晶，分离猪去氧胆酸与鹅去氧胆酸，以增加猪去氧胆酸收益，纯化鹅去氧胆酸，具体要求是在收集的混合胆酸中加甲醇使之酸化形成混合胆酸甲脂，经减压蒸馏回收甲醇后得甲酯混合物，然后再加入甲苯，搅拌至完全热溶后，经结晶后再进行离心处理取结晶物，收取的结晶物采用甲苯洗涤后再次进行重结晶，重结晶通过皂化处理后，再进行脱醇、水溶和酸化处理，收取的沉淀物经减压干燥得猪去氧胆酸；对结晶母液以及洗涤液收集合并后，经减压蒸馏回收甲苯，取浓缩物通过皂化处理后，再进行脱醇、水溶和酸化处理，最后收取的沉淀物经热水浸泡后过滤得沉淀物为鹅去氧胆酸；(3)合成熊去氧胆酸：将步骤(2)中分离后所得的鹅去氧胆酸先进行加氢使其还原后，再加入丙酮进行脱氢处理，所得溶液经浓缩后再进行酸化处理，滤液再经过弱酸性阳离子交换树脂柱，过柱液以稀盐酸调节其pH值，再离心处理收取沉淀，并以纯水洗涤至近中性，再于回流装置中加入甲醇热溶，经本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从猪胆汁中合成熊去氧胆酸和牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于：所述方法包括有提取混合胆酸、分离混合胆酸、合成熊去氧胆酸以及牛磺熊去氧胆酸，以猪胆汁为原料，采取酶解、超滤和纳滤的方法进行前端除杂来提取混合胆酸，并对提取的混合胆酸进行分离，然后合成熊去氧胆酸及牛磺熊去氧胆酸，具体包括以下步骤：(1)提取混合胆酸:首先将猪胆汁干粉加入量纯水和复合蛋白酶进行控温酶解得酶解液；酶解液加入沉淀剂进行离心过滤后，收取澄清液；澄清液经过超滤和纳滤后，并在收取的浓缩液中加入脱色剂进行脱色后，对所得的脱色液进行酸化处理，再进行离心处理收取沉淀物；最后将沉淀物经过甲酯化处理，收取脱溶物经水洗后即得所述混合胆酸；(2)分离混合胆酸：将步骤(1)中所得的混合胆酸先加入甲醇使之酸化形成混合胆酸甲脂，经过脱醇后得甲酯混合物再通过酯化与结晶，分离猪去氧胆酸与鹅去氧胆酸，以增加猪去氧胆酸收益，纯化鹅去氧胆酸，具体要求是在收集的混合胆酸中加甲醇使之酸化形成混合胆酸甲脂，经减压蒸馏回收甲醇后得甲酯混合物，然后再加入甲苯，搅拌至完全热溶后，经结晶后再进行离心处理取结晶物，收取的结晶物采用甲苯洗涤后再次进行重结晶，重结晶通过皂化处理后，再进行脱醇、水溶和酸化处理，收取的沉淀物经减压干燥得猪去氧胆酸；对结晶母液以及洗涤液收集合并后，经减压蒸馏回收甲苯，取浓缩物通过皂化处理后，再进行脱醇、水溶和酸化处理，最后收取的沉淀物经热水浸泡后过滤得沉淀物为鹅去氧胆酸；(3)合成熊去氧胆酸：将步骤(2)中分离后所得的鹅去氧胆酸先进行加氢使其还原后，再加入丙酮进行脱氢处理，所得溶液经浓缩后再进行酸化处理，滤液再经过弱酸性阳离子交换树脂柱，过柱液以稀盐酸调节其pH值，再离心处理收取沉淀，并以纯水洗涤至近中性，再于回流装置中加入甲醇热溶，经降温后调节pH值，滤取结晶后再用纯水洗涤至中性，最后减压干燥即得熊去氧胆酸；(4)合成牛磺熊去氧胆酸：将步骤(3)中所得熊去氧胆酸加入缩合剂进行活化，经活化后所得混合液进行碱化处理后得溶解液，溶解液再进行酰化反应后，经过滤后所得沉淀物采用纯水洗涤后，再用丙酮热溶，速降温后静放，滤取结晶，并用乙醚洗涤后，再用冷纯水洗至无乙醚味时，最后减压干燥即得牛磺熊去氧胆酸。...

【技术特征摘要】
1.一种从猪胆汁中合成熊去氧胆酸和牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于：所述方法包括有提取混合胆酸、分离混合胆酸、合成熊去氧胆酸以及牛磺熊去氧胆酸，以猪胆汁为原料，采取酶解、超滤和纳滤的方法进行前端除杂来提取混合胆酸，并对提取的混合胆酸进行分离，然后合成熊去氧胆酸及牛磺熊去氧胆酸，具体包括以下步骤：(1)提取混合胆酸:首先将猪胆汁干粉加入量纯水和复合蛋白酶进行控温酶解得酶解液；酶解液加入沉淀剂进行离心过滤后，收取澄清液；澄清液经过超滤和纳滤后，并在收取的浓缩液中加入脱色剂进行脱色后，对所得的脱色液进行酸化处理，再进行离心处理收取沉淀物；最后将沉淀物经过甲酯化处理，收取脱溶物经水洗后即得所述混合胆酸；(2)分离混合胆酸：将步骤(1)中所得的混合胆酸先加入甲醇使之酸化形成混合胆酸甲脂，经过脱醇后得甲酯混合物再通过酯化与结晶，分离猪去氧胆酸与鹅去氧胆酸，以增加猪去氧胆酸收益，纯化鹅去氧胆酸，具体要求是在收集的混合胆酸中加甲醇使之酸化形成混合胆酸甲脂，经减压蒸馏回收甲醇后得甲酯混合物，然后再加入甲苯，搅拌至完全热溶后，经结晶后再进行离心处理取结晶物，收取的结晶物采用甲苯洗涤后再次进行重结晶，重结晶通过皂化处理后，再进行脱醇、水溶和酸化处理，收取的沉淀物经减压干燥得猪去氧胆酸；对结晶母液以及洗涤液收集合并后，经减压蒸馏回收甲苯，取浓缩物通过皂化处理后，再进行脱醇、水溶和酸化处理，最后收取的沉淀物经热水浸泡后过滤得沉淀物为鹅去氧胆酸；(3)合成熊去氧胆酸：将步骤(2)中分离后所得的鹅去氧胆酸先进行加氢使其还原后，再加入丙酮进行脱氢处理，所得溶液经浓缩后再进行酸化处理，滤液再经过弱酸性阳离子交换树脂柱，过柱液以稀盐酸调节其pH值，再离心处理收取沉淀，并以纯水洗涤至近中性，再于回流装置中加入甲醇热溶，经降温后调节pH值，滤取结晶后再用纯水洗涤至中性，最后减压干燥即得熊去氧胆酸；(4)合成牛磺熊去氧胆酸：将步骤(3)中所得熊去氧胆酸加入缩合剂进行活化，经活化后所得混合液进行碱化处理后得溶解液，溶解液再进行酰化反应后，经过滤后所得沉淀物采用纯水洗涤后，再用丙酮热溶，速降温后静放，滤取结晶，并用乙醚洗涤后，再用冷纯水洗至无乙醚味时，最后减压干燥即得牛磺熊去氧胆酸。2.根据权利要求1所述的从猪胆汁中合成熊去氧胆酸和牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)中提取混合胆酸的方法包括以下步骤：(1)将猪胆汁干粉称重后，加入5～6倍量的纯水、0.5%的10万U/g活性复合蛋白酶进行酶解，调节pH值在9～11之间，控制酶解温度在50～55℃之间，并不断搅拌2h后，升温至90℃停热，趁热加入5～10%体积比ZTC-B的1%溶液，搅均，再加入3～5%体积比ZTC-A的1%溶液，经搅均后，离心取澄清液；(2)将步骤(1)中收取的澄清液降温至≤45℃，再次调节pH值在9～11之间，经过1KD超滤取透过液，再经过300D纳滤取浓缩液，加入1～3%体积比的双氧水进行脱色处理，经搅均后，静放24h后，经离心处理取滤液，所得滤液以10%的盐酸调节pH值至2后，静放分层，再次离心处理收取沉淀物，最后将沉淀物用纯水反复洗涤至近中性；(3)将步骤(2)中收取的沉淀置于回流装置内，并加入7～8倍量的无水甲醇进行酯化处理，控制酯化温度在48～52℃之间，经搅均后滴加沉淀量8%的浓硫酸或浓盐酸，以流速5BV/h通入与沉淀等量的活性氧化铝脱水剂柱进行柱洗，反复过柱≥8h，然后减压蒸馏回收甲醇，收取脱溶物经水洗后得沉淀物即得混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：李能强，
申请(专利权)人：贵州慧静生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：贵州,52