本发明专利技术涉及药物化学领域，具体公开了一种利用HTRF技术筛选UBC12/Dcn1小分子抑制剂的方法。该方法先成功构建并原核表达纯化得到纯度较高的GST‑Dcn1重组蛋白，合成UBC12 N末端乙酰化修饰的1‑12个氨基酸序列作为底物。用分子间相互作用确定UBC12和Dcn1有活性并且能相互作用；然后再利用HTRF技术建立优化的UBC12/Dcn1活性测定平台。该反应体系稳定，可耐受较宽的pH范围(5.5‑8.0)及二价金属离子、螯合物等；背景低，受到样品的干扰非常少，假阳性假阴性均低，可去除天然产物自发荧光的干扰，灵敏度高；易于实现微型化，通量高。
【技术实现步骤摘要】
利用HTRF技术筛选UBC12/Dcn1小分子抑制剂的方法
本专利技术涉及药物化学领域，具体涉及利用HTRF技术筛选UBC12/Dcn1小分子抑制剂的方法。
技术介绍
泛素(ubiquitin)可共价结合并修饰细胞内多种蛋白质，使其多聚泛素化被26S蛋白酶体识别而降解，这种蛋白质翻译后修饰已经成为当今细胞分子生物学研究的热点。目前各种类泛素修饰蛋白也不断被发现，如SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier)、NEDD8(neuralprecursorcell-expresseddevelopmentallydownregulated8)、Atg8(autophagygene8)和Atg12等。其中，NEDD8与泛素高度同源，具有60％的一致性和80％的相似性。NEDD8特异性地结合到底物蛋白赖氨酸残基上的修饰过程被称为Neddylation，Neddylation与泛素化类似,也需要经过NEDD8特异性E1、E2、E3将NEDD8传递到底物CRLs(Cullin-RING-ubiquitinligases)上。NAE(APPBP1/UBA3异质二聚体)活化NEDD8并将其转移到E2结合酶UBC12或UBE2F上，然后E2结合酶和E3连接酶相互作用使NEDD8与CRLs上的cullin蛋白C端赖氨酸残基结合，进而活化CRLs加速其底物蛋白的降解(Huangetal.,2009；Lecketal.,2010；Lietal.,2014)。Neddylation通路异常可以诱发癌症(Gaoetal.,2014；Lietal.,2014)及免疫应答疾病(LeNegrate,2012；Mathewsonetal.,2013)。抑制Neddylation通路可以引起细胞周期阻滞、衰老或凋亡，从而抑制细胞增殖；也可以抑制IκB的泛素化降解从而减少NF-κB的移位和活化，进而抑制免疫应答疾病。在neddylation过程中E2结合酶发挥重要作用，首先E2与E1结合，NEDD8传递到E2上与E2形成硫酯键。对于RINGE3，E2与E3相互作用将NEDD8直接传递到CRLs上。其中，NEDD8从UBC12传递到Cullins的过程涉及两个E3：①RBX1，一种RINGE3，其RING结构域与UBC12和Cullin1相互作用将UBC12的催化活性位点Cys111和CUL1上NEDD8结合位点Lys720拉近，使NEDD8从UBC12直接传递到CUL1上；②Dcn1(Defectiveincullinneddylation1，也叫做SCCRO、DCUN1DI)，一种co-E3，是neddylationscaffold-typeE3连接酶的组分之一，可以直接与NEDD8、RBX1和Cullin1结合(Heiretal.,2013；Huangetal.,2011；Kimetal.,2008；Kurzetal.,2008)。在细胞核内，Dcn1加强Cullin1对UBC12的招募,促进neddylation，也可催化NEDD8连接到Cullin2的K689。Dcn1晶体结构主要包括UBA结构域和PONY(potentiatingneddylation)结构域两部分。Dcn1PONY(Dcn1p)结构域中两个EF-hand-like折叠连接处形成一个保守的疏水口袋，与N末端乙酰化的UBC12相互作用加强neddylation过程(Mondaetal.,2013；Scottetal.,2011；Scottetal.,2010)。Dcn1已被报道是一种致癌基因，Dcn1的mRNA和蛋白水平在多种肿瘤，如肺癌、头颈癌等及癌症病人组织中均高表达，Dcn1过表达也可促进癌细胞的增值和转移，Dcn1knockdown可以引起癌细胞的周期阻滞和凋亡(Sarkariaetal.,2006)。综上所述，通过建立UBC12/Dcn1抑制剂筛选平台，筛选出能抑制neddylation通路的化合物对癌症及免疫性疾病的治疗有重要意义，因此，UBC12/Dcn1可以作为一个治疗靶点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用HTRF技术建立UBC12/Dcn1抑制剂筛选平台，筛选出能抑制neddylation通路的先导化合物。HTRF(均相时间分辨荧光，HomogeneousTime-ResolvedFluorescence)结合了荧光共振能量转移(FRET,FluorescenceResonanceEnergyTransfer)和时间分辨荧光(TRF，Time-ResolvedFluorescence)两种技术，将FRET的均相实验方式和TRF的低背景特点融合在一起。因此，HTRF技术具有操作简单、灵敏度高、通量大、实验数据稳定可靠的特点。HTRF是以铕穴状化合物(Eu3+cryptate)或Lumi4TM铽穴状化合物(Tb2+cryptate)为能量供体(Donor)，能耐受一些特殊的实验条件，如二价阳离子(Mg2+和Mn2+等)、螯合物(EDTA)、极性较强的溶剂或者较高的温度，可耐受较宽的pH范围；以XL665或d2为能量受体(Acceptor)，XL665和d2激发波长为620nm，发射波长为665nm，位于近红外光区，进一步降低了样品本身对实验的影响。XL665是改良过的别藻蓝蛋白(APC),将APC的亚基偶联，使其不能解离，增加其稳定性；d2光谱学特征与XL665相同，但其分子量较小，可减少空间位阻对实验的影响。HTRF技术的原理：两种能相互作用的生物分子使荧光基团Donor和Acceptor靠近，穴状化合物Donor捕获激发光获得的能量部分释放，发射波长为620nm，另一部分能量共振转移到AcceptorXL665或d2，使其发射能量，发射波长为665nm。发射波长665nm的信号值与620nm时信号值的比值能反映出两种生物分子相互作用的强度。为达到本专利技术目的，本专利技术先成功构建并原核表达纯化得到纯度较高的GST-Dcn1重组蛋白，合成UBC12N末端乙酰化修饰的1-12个氨基酸序列作为底物。首先用分子间相互作用确定UBC12和Dcn1是有活性的并且能相互作用；然后再利用HTRF技术建立UBC12/Dcn1活性测定平台，并优化其反应条件。具体步骤如下：一、GST-Dcn1重组蛋白的表达纯化1、GST-Dcn1表达载体的构建：选择合适的表达载体及目的基因活性片段。选择的表达载体要能表达出可溶性的目的蛋白，要有明确的抗性及标签，方便目的蛋白的表达和纯化。选择的目的基因序列要包括其活性中心，确保后续实验的可行性；为此，本专利技术筛选出的表达载体为PGEX-4T-1；目的基因序列活性片段为GST-Dcn1，将其克隆到表达载体上。2、GST-Dcn1重组蛋白的表达：将构建成功的目的载体转化进入合适的表达菌株，将菌液均匀涂布到混有抗生素的固体培养基上，挑单克隆筛选出含有目的质粒的菌株进行培养。表达蛋白时先将目的菌株接种到液体培养基中37℃进行扩大培养，待菌处于生长期(OD0.6-0.9)时加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导目的蛋白的表达；所述表达菌株选BL21(DE3)，所述抗生素选氨苄青霉素，终浓度100μg/ml；3本文档来自技高网...
【技术保护点】
利用HTRF技术筛选UBC12/Dcn1小分子抑制剂的方法，其特征在于，通过如下步骤实现：(1)GST‑Dcn1重组蛋白的表达纯化（a）GST‑Dcn1表达载体的构建：选择表达载体PGEX‑4T‑1及目的基因活性片段GST‑Dcn1，将其克隆到表达载体上;(b) GST‑Dcn1重组蛋白的表达：将步骤（a）构建成功的目的载体转化进入BL21(DE3)表达菌株中，将菌液均匀涂布到混有抗生素的固体培养基上，挑单克隆筛选出含有目的质粒的菌株进行培养：表达蛋白时先将目的菌株接种到液体培养基中37℃进行扩大培养，待菌处于生长期OD 0.6‑0.9时加入异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导目的蛋白的表达；所述抗生素选氨苄青霉素，终浓度100µg/ml ；(c) GST‑Dcn1重组蛋白的纯化：离心收集步骤（b）菌液中的菌体，然后超声破碎释放目的蛋白，高速离心弃去菌体碎片，得到目的蛋白溶液;根据构建表达载体时选择的载体特征选择合适的纯化柱、纯化条件、缓冲液纯化收集蛋白样品；(d) 表达纯化结果：取步骤（c）蛋白纯化时收集的蛋白样品，加入蛋白loading buffer 变性，然后SDS‑PAGE胶电泳，用考马斯亮蓝染液染胶，在目的蛋白大小处有蛋白条带;(2)HTRF技术筛选UBC12/Dcn1小分子抑制剂平台的建立根据HTRF方法特征选择检测试剂，缓冲溶液中，检测UBC12和Dcn1的相互作用；通过发射波长665nm时的信号值与620nm时信号值的比值判断两种生物分子相互作用的强度，从而筛选UBC12/Dcn1小分子抑制剂。...
【技术特征摘要】
1.利用HTRF技术筛选UBC12/Dcn1小分子抑制剂的方法，其特征在于，通过如下步骤实现：(1)GST-Dcn1重组蛋白的表达纯化（a）GST-Dcn1表达载体的构建：选择表达载体PGEX-4T-1及目的基因活性片段GST-Dcn1，将其克隆到表达载体上;(b)GST-Dcn1重组蛋白的表达：将步骤（a）构建成功的目的载体转化进入BL21(DE3)表达菌株中，将菌液均匀涂布到混有抗生素的固体培养基上，挑单克隆筛选出含有目的质粒的菌株进行培养：表达蛋白时先将目的菌株接种到液体培养基中37℃进行扩大培养，待菌处于生长期OD0.6-0.9时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导目的蛋白的表达；所述抗生素选氨苄青霉素，终浓度100µg/ml；(c)GST-Dcn1重组蛋白的纯化：离心收集步骤（b）菌液中的菌体，然后超声破碎释放目的蛋白，高速离心弃去菌体碎片，得到目的蛋白溶液;根据构建表达载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘宏民，赵丽杰，郑一超，王志茹，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南,41
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