细菌或真菌的活性快速检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种细菌或真菌的活性快速检测方法。细菌或真菌的活性快速检测方法，包括步骤：1)首先配制多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液；然后将多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液、靶细胞和载体混合均匀，在载体表面进行聚合反应得到靶细胞‑丹磺酰多巴胺/多巴胺‑载体复合体；最后利用洗脱剂将靶细胞从复合体上洗脱下来，得到靶细胞的荧光分子印迹聚合物；2)向荧光分子印迹聚合物中加入样品后即刻测定荧光值为I0，待样品中的细菌或真菌与荧光分子印迹聚合物结合完全后，测定荧光值为I，I0/I‑1表示荧光变化水平，通过荧光变化水平确定样品中靶细菌或靶真菌的含量。该方法能快速准确地检测出样品中细菌或真菌的活性。

【技术实现步骤摘要】
细菌或真菌的活性快速检测方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种细菌或真菌的活性快速检测方法。
技术介绍
细菌和真菌广泛存在于自然界和人体内，致病性细菌和真菌可严重危害生命体健康。据统计，全球约有三分之一的死亡与细菌感染性疾病相关。病原菌侵染机体引起病变，通常需要：①侵入并定植于机体；②在宿主体内增殖并向其它部位扩散；③逃避机体防御机制；④释放毒素或引发超敏反应。其中有活性的病原菌侵入机体是细菌感染的第一步，是致病菌引起机体病变的首要条件，因此快速、准确、灵敏的细菌活性检测方法对减少相关疾病发生，维护人类的健康至关重要。细菌或真菌的活性检测的传统方法是分离和选择性培养，有平板计数法、滤膜法、多管发酵法等，这些方法不需要大型仪器，可以检测活细菌或真菌，其缺点是耗时长、效率低，不能满足水质监测、食品卫生、临床诊断所需的快速检测的要求。常见细菌或真菌的活性快速检测方法是基于PCR技术的研究。普通PCR难以区分活菌与死菌，但可通过核酸交联剂透过细胞膜与死菌DNA结合，抑制死菌DNA扩增；或扩增仅存在于活菌中的mRNA，达到检测活菌的目的。但是由于PCR对很少的DNA即可有很好的扩增效果，这种方法难以将死菌的DNA或mRNA完全去除，导致假阳性很高，无法满足实际需要。因此，开发更快速且更准确的细菌活性检测方法，在环境、医学、农业、食品等多个领域具有重要的用途。为了开发快速准确的细菌或真菌的活性检测方法，本专利技术利用分子印迹聚合物(molecularlyimprintedpolymers，MIPs)，目前，已有不少研究者对细菌或真菌的MIPs进行研究，在细菌MIPs中，部分研究者以细菌表面蛋白为模板制备MIPs，例如Khan等人在单壁碳纳米管上，以金黄色葡萄球菌外层有代表性的蛋白A为模板，通过循环伏安法使3-氨基酚发生电聚合制备MIPs，在有牛血清白蛋白干扰的情况下，MIPs对模板仍有良好的选择性(KhanMSR,MoreiraFTC,RiuJetal.Plasticantibodyfortheelectrochemicaldetectionofbacterialsurfaceproteins.SensorActuatB-Chem,2016,233:697-704.)。Jiang等人在磁性纳米颗粒表面，以革兰阴性菌的信号分子AHLs为模板，通过表面印迹制备了MIPs，可对细菌进行间接检测(JiangH,JiangD,ShaoJetal.MagneticmolecularlyimprintedpolymernanoparticlesbasedelectrochemicalsensorforthemeasurementofGram-negativebacterialquorumsignalingmolecules(N-acyl-homoserine-lactones).BiosensBioelectron,2016,75:411-419.)。Idil等人以整个大肠杆菌为模板，以N-甲基丙烯酰-L-组氨酸、2-甲基丙烯酸羟乙酯为功能单体，以乙二醇二甲基丙烯酸为交联剂，用紫外光进行引发，制备大肠杆菌MIPs，可特异性吸附模板大肠杆菌。对大肠杆菌的检出限为70CFU/mL，检测范围为1.0×102-1.0×107CFU/mL。该方法用于果汁和河水中加标大肠杆菌的检测，回收率为81-97％(IdilN,HedstromM,DenizliAetal.WholecellbasedmicrocontactimprintedcapacitivebiosensorforthedetectionofEscherichiacoli.BiosensBioelectron,2017,87:807-815.)。Roy等人以整个大肠杆菌为模板，以N,N’-亚甲基双丙烯酰胺为功能单体制备大肠杆菌MIPs。与亚铁/铁氰化物氧化还原探针连用，可实现对大肠杆菌的检测，且与大肠杆菌在10-109CFU/mL范围线性相关，检出限为10CFU/mL。除了能检测外，该材料还可从水样中捕获超过98％的大肠杆菌。最后该材料还可以通过光热在5分钟内杀死105CFU/mL大肠杆菌(RoyE,PatraS,TiwariAetal.SinglecellimprintingonthesurfaceofAg-ZnObimetallicnanoparticlemodifiedgrapheneoxidesheetsfortargeteddetection,removalandphotothermalkillingofE.Coli.BiosensBioelectron,2017,89(Pt1):620-626.)。以上研究均表明细菌MIPs可特异性结合并检测靶细菌，但以上工作均未研究MIPs是否可以测定细菌或真菌活性，而且上述检测细菌或真菌的MIPs的操作较为复杂。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术的目的是提供一种细菌或真菌的活性快速检测方法，能快速准确地检测出细菌或真菌样品中细菌或真菌的活性。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：细菌或真菌的活性快速检测方法，包括以下步骤：1)制备靶细胞的荧光分子印迹聚合物：首先称取多巴胺和丹磺酰多巴胺，配制多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液；然后将多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液、靶细胞和载体混合均匀，以靶细胞为模板、丹磺酰多巴胺为荧光功能单体、多巴胺为功能单体，在载体表面进行聚合反应得到靶细胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体；最后利用洗脱剂将靶细胞从靶细胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体上洗脱下来，得到靶细胞的荧光分子印迹聚合物；2)检测细菌活性：向荧光分子印迹聚合物中加入细菌或真菌样品后即刻测定荧光值为I0，待细菌或真菌样品中的细菌或真菌与荧光分子印迹聚合物结合完全后，测定荧光值为I，I0/I-1表示荧光变化水平，通过荧光变化水平确定样品中是否含有靶细菌或靶真菌以及该靶细菌或靶真菌的含量。作为优选方案，所述步骤1)中载体为经聚多巴胺修饰后得到的多巴胺-载体复合体，所述多巴胺-载体复合体是通过将多巴胺和载体材料混合，并在过硫酸铵催化作用下，多巴胺在载体材料表面发生自聚合反应而制得。作为优选方案，所述载体材料为纳米微球、微米微球或多孔板。作为优选方案，所述靶细胞为靶细菌或靶真菌，所述靶细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，所述靶细菌的浓度为104～106CFU/mL。作为优选方案，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌或蜡样芽孢杆菌；所述靶真菌为酵母菌。作为优选方案，所述多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液中包括多巴胺、丹磺酰多巴胺和催化剂。作为优选方案，所述催化剂为过硫酸铵。作为优选方案，所述多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液中多巴胺、丹磺酰多巴胺、过硫酸铵的摩尔比为4:1:1。作为优选方案，所述洗脱剂为去离子水。本专利技术制得的荧光分子印迹聚合物在检测水样中细菌活性及其含量的应用。具体方法为，将以荧光分子印迹聚合物为敏感膜制成荧光分子印迹聚合物传感器(fMIPs传感器)，将fMIPs传感器投置于待检测的水样中，通过fMIPs传感器的荧光值变化得出水样中的靶细菌和靶真菌的含量。本专利技术的细菌或真菌的活性快速检测方法的原理是：分子印迹聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细菌或真菌的活性快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)制备靶细胞的荧光分子印迹聚合物：首先称取多巴胺和丹磺酰多巴胺，配制多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液；然后将多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液、靶细胞和载体混合均匀，以靶细胞为模板、丹磺酰多巴胺为荧光功能单体、多巴胺为功能单体，在载体表面进行聚合反应得到靶细胞‑丹磺酰多巴胺/多巴胺‑载体复合体；最后利用洗脱剂将靶细胞从靶细胞‑丹磺酰多巴胺/多巴胺‑载体复合体上洗脱下来，得到靶细胞的荧光分子印迹聚合物；2)检测细菌活性：向荧光分子印迹聚合物中加入细菌或真菌样品后即刻测定荧光值为I0，待细菌或真菌样品中的细菌或真菌与荧光分子印迹聚合物结合完全后，测定荧光值为I，I0/I‑1表示荧光变化水平，通过荧光变化水平确定样品中是否含有靶细菌或靶真菌以及该靶细菌或靶真菌的含量。

【技术特征摘要】
1.一种细菌或真菌的活性快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)制备靶细胞的荧光分子印迹聚合物：首先称取多巴胺和丹磺酰多巴胺，配制多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液；然后将多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液、靶细胞和载体混合均匀，以靶细胞为模板、丹磺酰多巴胺为荧光功能单体、多巴胺为功能单体，在载体表面进行聚合反应得到靶细胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体；最后利用洗脱剂将靶细胞从靶细胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-载体复合体上洗脱下来，得到靶细胞的荧光分子印迹聚合物；2)检测细菌活性：向荧光分子印迹聚合物中加入细菌或真菌样品后即刻测定荧光值为I0，待细菌或真菌样品中的细菌或真菌与荧光分子印迹聚合物结合完全后，测定荧光值为I，I0/I-1表示荧光变化水平，通过荧光变化水平确定样品中是否含有靶细菌或靶真菌以及该靶细菌或靶真菌的含量。2.根据权利要求1所述的细菌或真菌的活性快速检测方法，其特征在于：所述步骤1)中载体为经聚多巴胺修饰后得到的多巴胺-载体复合体，所述多巴胺-载体复合体是通过将多巴胺和载体材料混合，并在过硫酸铵催化作用下，多巴胺在载体材料表面发生自聚合反应而制得。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕斌，刘燕婕，李宁，叶磊，吴中乔，邓耘，项阳，
申请(专利权)人：武汉汉瑞隆德检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42