一种检测禽白细胞介素10含量的方法及其专用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测禽白细胞介素10含量的方法及其专用试剂盒。本发明专利技术利用chIL‑10单克隆抗体建立了针对chIL‑10在蛋白水平上的双夹心ELISA检测方法。通过实验证明：本发明专利技术的抗chIL‑10单克隆抗体具有良好的特异性和亲和力，能够准确地反映出血清或细胞上清中chIL‑10的含量，且本发明专利技术的检测方法快捷、高效又准确，解决了现有技术中采用荧光定量PCR检测方法带来的操作繁琐，耗时耗力，易受操作及其他外部条件影响等问题，不仅有助于评价chIL‑10在机体内的动态变化水平，为疾病的预防和治理提供很好的参考，而且有助于了解禽类传染性疾病的发生、发展、转归情况及机体保护性免疫反应的动态。

Method for detecting content of avian interleukin 10 and its special reagent kit

The invention discloses a method for detecting the content of avian interleukin 10 and a special reagent box for detecting the content. The invention uses chIL 10 monoclonal antibody was established according to chIL 10 at the protein level of the sandwich ELISA detection method. Experimental results show that the anti chIL 10 monoclonal antibodies with high specificity and affinity, can accurately reflect the content of chIL 10 serum or cell supernatant, and the detecting method of the invention is fast, efficient and accurate, solves the detection method using fluorescence quantitative PCR to bring the operation tedious, time-consuming, easy operation and other affected by external conditions and other issues, not only contribute to the evaluation of chIL 10 in vivo dynamic changes, provide a good reference for the prevention and treatment of disease, but also contribute to the understanding of poultry infectious diseases occurrence, development, prognosis and body protection immunity dynamic.

【技术实现步骤摘要】
一种检测禽白细胞介素10含量的方法及其专用试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测禽白细胞介素10(IL-10)含量的方法及其专用试剂盒。
技术介绍
1989年，Fiorentino等最先描述了白介素10是一种由2型辅助T细胞(Th2)分泌的、抑制Th1细胞中IL-2和IFN-γ合成的新的免疫介质。2004年，LisaRothwell等从感染艾美耳球虫的鸡盲肠扁桃体提取总RNA，经RT-PCR获得chIL-10的全长cDNA序列，其编码一条175个氨基酸的多肽，其中有21个氨基酸组成信号肽，成熟肽段长154个氨基酸。鸡IL-10与人IL-10和鼠IL-10的氨基酸序列同源性分别为45％和42％。鸡IL-10基因包含5个外显子和4个内含子。树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞等细胞可以分泌IL-10，此外，TH1、TH2、TH17、Treg以及B细胞亚群也被证实可以分泌IL-10。IL-10能够抑制CD4+T细胞的增殖和细胞因子包括Th1型IL-2、IFN-γ和Th2型IL-4、IL-5的合成。IL-10抑制单核/巨噬细胞释放炎症介质，并因此抑制了LPS和IFN-γ诱导其分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、G-CSF和GM-CSF。此外，IL-10可以阻止B细胞凋亡，增强其增殖、分化和MHCII类分子的表达，而且在Ig类别转换中IL-4起着积极的作用。IL-10在调节免疫系统中发挥重要作用。目前，已有在蛋白水平上检测人和小鼠IL-10的商品化试剂盒，但是由于chIL-10与人和小鼠IL-10的同源性仅分别为45％和42％，所以目前国内，无论是在学术研究还是临床疾病分析中主要还是以荧光定量PCR检测chIL-10的相对含量。但由于mRNA水平与蛋白水平并不呈绝对的线性关系，所以应用荧光定量PCR并不能反应出鸡IL-10蛋白的实际水平，故其并不能作为一个检测鸡IL-10蛋白量的实验技术而应用，同时荧光定量PCR技术操作繁琐，对专业技能要求较高且价格昂贵，不宜用于生产实际。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供抗chIL-10的单克隆抗体。本专利技术提供的抗chIL-10的单克隆抗体是由保藏号为CGMCCNo.13836的杂交瘤细胞株1G11和保藏号为CGMCCNo.13837的杂交瘤细胞株1D6分泌的。将保藏号为CGMCCNo.13836的杂交瘤细胞株1G11分泌的抗chIL-10的单克隆抗体命名为1G11抗体，将保藏号为CGMCCNo.13837的杂交瘤细胞株1D6分泌的抗chIL-10的单克隆抗体命名为1D6抗体。本专利技术的第二个目的是提供分泌抗chIL-10的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术提供的分泌抗chIL-10的单克隆抗体的杂交瘤细胞株为1G11和1D6。杂交瘤细胞株1G11的分类命名为杂交瘤细胞系(小鼠来源)，该杂交瘤细胞株已于2017年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.13836。杂交瘤细胞株1D6的分类命名为杂交瘤细胞系(小鼠来源)，该杂交瘤细胞株已于2017年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.13837。本专利技术的第三个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的酶联免疫试剂盒。本专利技术提供的检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的酶联免疫试剂盒包括上述1G11抗体和/或1D6抗体。上述酶联免疫试剂盒还包括chIL-10标准品；所述chIL-10标准品是通过将核苷酸序列如序列表中序列1所示的chIL-10基因在原核细胞中进行表达获得的。所述酶联免疫试剂盒中还包括如下中的至少一种：酶标板、包被缓冲液、洗涤缓冲液、抗体稀释液、封闭液、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP标记的链霉亲和素)、显色液和终止液。本专利技术的第四个目的是提供上述抗chIL-10的单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株或上述酶联免疫试剂盒的新用途。本专利技术提供了上述抗chIL-10的单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株或上述酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量中的应用。上述抗chIL-10的单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株在制备检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的试剂或胶体金试纸条或试剂盒中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的方法。本专利技术提供的检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的方法是以1G11抗体为包被抗体、生物素化的1D6抗体为检测抗体的双抗体夹心ELISA检测方法。上述方法检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的方法具体包括如下步骤：(1)将1G11抗体包被到酶标板上，洗涤；(2)封闭(1)得到的酶标板，洗涤；(3)向(2)得到的酶标板中加入chIL-10标准品或待测样品，孵育，洗涤；(4)向(3)得到的酶标板中加入生物素化的1D6抗体，孵育，洗涤；(5)向(4)得到的酶标板中加入HRP标记的链霉亲和素，孵育，洗涤；(6)向(5)得到的酶标板中加入底物显色，显色后加入终止液终止反应；(7)用酶标仪检测加入chIL-10标准品的各孔的吸光度值，以chIL-10标准品浓度为横坐标、以酶标仪的读数为纵坐标绘制标准曲线；(8)用酶标仪检测加入待测样品的孔的吸光度值，将吸光度值代入所述标准曲线，即得待测样品中chIL-10的浓度。上述方法中，所述步骤(1)中，用碳酸盐缓冲液将1G11抗体稀释后包被到酶标板上；所述步骤(2)中，用脱脂奶溶液封闭(1)得到的酶标板；所述步骤(3)中，用BSA溶液将chIL-10标准品稀释后加入酶标板中；所述步骤(4)中，用BSA溶液将生物素化的1D6抗体稀释至1μg/mL后加入酶标板中。所述生物素化的1D6抗体的制备方法参照抗体生物素标记试剂盒(购自ThermoScientific，Prod#21440)中说明书中的方法。上述方法中，所述步骤(1)中，所述抗体的浓度稀释为4μg/mL；所述包被的条件为4℃包被12h；所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.05M，pH为9.6；所述步骤(2)中，所述脱脂奶溶液(溶剂为洗涤缓冲液)的质量分数为5％；所述封闭的条件为37℃封闭3h；所述BSA溶液(溶剂为洗涤缓冲液)的质量分数为1％；所述步骤(3)中，所述孵育时间为2h；所述步骤(4)中，所述孵育时间为45min；所述步骤(5)中，所述孵育时间为15min；所述用酶标仪检测吸光度值时的波长为450nm；所述底物为TMB；所述终止液为2MH2SO4。本专利技术在酶联免疫的基础上结合生物素-链霉亲和素系统建立双抗体夹心ELISA，该方法利用标记了抗体的生物素和HRP标记的链霉亲和素之间的高亲和力及高特异性结合，使大量的酶分子聚集在抗原抗体复合物周围，产生多级放大作用，使每个抗体携带的酶分子显著增加，从而极大地提高灵敏度。与荧光定量PCR相比，本专利技术所建立的双抗体夹心ELISA本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗chIL‑10的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No.13836的杂交瘤细胞株1G11分泌的。

【技术特征摘要】
1.抗chIL-10的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCCNo.13836的杂交瘤细胞株1G11分泌的。2.抗chIL-10的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCCNo.13837的杂交瘤细胞株1D6分泌的。3.一株分泌抗chIL-10的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1G11，其保藏号为CGMCCNo.13836。4.一株分泌抗chIL-10的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D6，其保藏号为CGMCCNo.13837。5.一种检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的酶联免疫试剂盒，其包括权利要求1所述的单克隆抗体和/或权利要求2所述的单克隆抗体。6.权利要求1或2所述的单克隆抗体或权利要求3或4所述的杂交瘤细胞株或权利要求5所述的酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量中的应用；或，权利要求1或2所述的单克隆抗体或权利要求3或4所述的杂交瘤细胞株在制备检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的试剂或胶体金试纸条或试剂盒中的应用。7.一种检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的方法，是以权利要求1所述的单克隆抗体为包被抗体、权利要求2所述的单克隆抗体为检测抗体的双抗体夹心ELISA检测方法。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)将权利要求1所述的单克隆抗体包被到酶标板上，洗涤；(2)封闭(1)得到的酶标板，洗涤；(3)向(2)得到的酶标板中加入chIL-10标准品或待测样品，孵育，洗涤；(4)向(3)得到的酶标板中加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑世军，高俊峰，王永强，李晓齐，曹红，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11