一种用于研究破骨细胞融合的荧光蛋白标记方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种用于研究破骨细胞融合的荧光蛋白标记方法，其特征在于：包括将含CTSK‑Cre转基因的小鼠原代骨髓单核细胞（bone marrow monocytes,BMMs）和含RosamTmG的转基因小鼠原代骨髓单核细胞3:1‑1:3的比例混合培养、进行破骨分化向诱导和荧光显微镜观察步骤，可以直观可视地观察破骨细胞融合过程，从而观察破骨细胞形态、细胞核数目及可以定量研究融合的细胞数目。

A fluorescent protein labeling method for the study of osteoclast fusion

The invention belongs to the field of biotechnology and relates to a fluorescent protein labeling method of osteoclast fusion, which is characterized by comprising CTSK containing Cre transgenic mouse primary bone marrow mononuclear cells (bone marrow monocytes, BMMs) and primary RosamTmG transgenic mice bone marrow mononuclear cells 3:1 1:3 mixed culture, to induce osteoclast differentiation and fluorescence microscopy steps can directly visually observe the fusion process of osteoclast, to observe osteoclasts, cell number and cell number can be quantitative study of fusion.

【技术实现步骤摘要】
一种用于研究破骨细胞融合的荧光蛋白标记方法
本专利技术属于医疗
，尤其是一种用于研究破骨细胞融合的荧光蛋白标记方法。
技术介绍
在本技术之前，用于观察破骨细胞融合的技术主要有两类：1.借助延时摄影显微镜(Time-lapsemicrescope)进行活细胞摄影；2.借助病毒包装原理进行研究。具体如下：延时摄影技术：即借助延时摄影显微镜每间隔一定时间采集明场中活细胞的图像，借此研究是否发生了破骨细胞的融合。但是明场情况下即便放大倍数很高也无法清晰直观地观察破骨细胞融合过程中细胞形态、细胞核数目等细节，更不能定量分析多少细胞发生了融合。因此无法研究干预因素对破骨细胞融合过程中细胞的形态、细胞核数目、融合的细胞数目等方面的影响。例如下例已发表的研究，如图7。在明场环境下只能观察到细胞间类似“相互靠近”的距离变化，而后发生了细胞形态的模糊改变。无法观察到具体的细胞结构、细胞核数目的改变；更无法定量分析此刻有多少细胞发生了融合。病毒包装原理：即将包装障碍的荧光报道基因标记的病毒质粒和辅助包装质粒分别转染到破骨前体细胞系Raw264.7中，若破骨前体细胞系发生了融合则会产生包装完成（具有感染能力）的成熟的荧光报道基因标记的病毒上清液。将这个上清液加到模式细胞系的培养基中，则模式细胞系被上述病毒感染后可在荧光显微镜下观察到荧光表达。但这个过程是间接地研究破骨细胞融合，完全不能观察到破骨细胞融合过程中细胞形态、细胞核数目等细胞形态学改变。并且也无法直接定量破骨细胞的融合数目。并且过程繁复耗时，病毒包装的技术复杂，所需实验仪器和试剂较多；更严重的是存在病毒感染的生物安全问题，不是每一个实验室都能开展研究（仅限具有病毒研究的生物安全等级较高的研究室）。实验示意图如图8。研发过程中遇到的难题：如何能够可视地、清晰地观察到破骨细胞融合的全程。并且在这个过程中还能观察到细胞形态、细胞核数目的改变。更难地是还要能用于定量研究干扰因素对破骨细胞融合效率的影响。如果能够得到便捷、清晰、直观、可视、便捷的技术去观察破骨细胞融合过程中细胞的形态、细胞核数目等细胞行为的改变；同时最好还能定量研究干预因素对破骨细胞融合效率的影响的方法，是现在的需求和发展趋势。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种用于研究破骨细胞融合的荧光蛋白标记方法，可以直观可视地观察破骨细胞融合过程，从而观察破骨细胞形态、细胞核数目及可以定量研究融合的细胞数目；也可以利用本荧光标记方法直观可视地观察到这些因素对融合过程、融合效率和融合中细胞行为产生了哪些影响，从而为研究破骨细胞融合提供了简便、可靠的工具。解决以上技术问题的本专利技术中的一种用于研究破骨细胞融合的荧光蛋白标记方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将含CTSK-Cre转基因的小鼠原代骨髓单核细胞（bonemarrowmonocytes,BMMs）和含RosamTmG的转基因小鼠原代骨髓单核细胞以3:1-1:3的比例混合培养；（2）进行破骨分化向诱导；（3）荧光显微镜观察。所述步骤（1）中混合培养前先Cre重组酶能特异性识别loxpDNA序列，使loxP位点间的基因序列被删除或重组，从而实现条件性基因打靶，混合培养后CTSK-Cre转基因的小鼠原代骨髓单核细胞与RosamTmG的转基因小鼠原代骨髓单核细胞发生融合，最终产生绿色荧光蛋白。CTSK在骨骼系统中是破骨细胞特异性表达的基因，因此Cre重组酶只在破骨细胞中表达。而RosamTmG转基因小鼠的细胞在无Cre重组酶时细胞膜表达红色荧光蛋白，而在Cre重组酶存在的情况下则通过上述Cre/loxp系统原理剪切掉红色荧光蛋白的基因而启动绿色荧光蛋白基因的表达，此时的细胞膜上表达绿色荧光蛋白。所述步骤（1）中培养条件为：含10%FBS，1%P/S的DMEM培养基，37℃恒温孵箱，5%二氧化碳，95%氧气。所述培养条件中，混合后细胞总量达到以下要求：A、96孔板细胞总量为3000-8000，培养基体积为100ul；B、其他的孔板或者培养皿应根据其底面积与96孔板的底面积进行比例换算，得到最终的混合细胞量。所述步骤（2）中诱导过程：混合培养的第一天在培养基中加入浓度为50ng/ml的MSCF（巨噬细胞集落刺激因子macrophagecolony-stimulatingfactor）,混合培养第三天全换液，液体为所述步骤（1）中配制的培养基，并加入50ng/mlMCSF+50ng/mlRANKL（核因子κB受体活化因子配体）。所述步骤（1）中CTSK-Cre转基因的小鼠原代骨髓单核细胞和含RosamTmG的转基因小鼠原代骨髓单核细胞以3:1-1:3的比例混合培养。所述步骤（3）荧光显微镜观察中红色荧光采用tdTomato适用的检测参数，激发峰554nm，发射峰581nm；绿色荧光采用EGFP适用的检测参数，激发峰488nm，发射峰507nm。本专利技术中破骨分化向诱导后第三天起开始观察。本专利技术中将两种转基因小鼠的骨髓单核细胞混合破骨向诱导培养，借助荧光显微镜即可观察到破骨细胞融合的过程（含CTSK-Cre的细胞若与含RosamTmG的细胞融合，则融合后的细胞中既含有Cre又含有RosamTmG；故融合后的细胞膜表达绿色荧光蛋白），并且能够可视化的得到融合过程中破骨细胞数目形态的变化以及定量分析发生了融合的破骨细胞数目（定量计数绿色荧光阳性的细胞数目）。本专利技术中还可以借助细胞核荧光染料如Hoechst或DAPI，从而观察融合过程中细胞核数目的改变。在荧光显微镜下观察前，可用终浓度为100ng/ml的DAPI染色1分钟或用终浓度为1ug/ml的Hoechst染色20分钟，去除染料后用PBS清洗3次，然后加入100ul的PBS于荧光显微镜下进行观察。在观察融合的方法中，本专利技术中方法直观、简单，具有无需进行细胞染色、不需要进行转染的优势。并且可以利用有无绿色荧光出现作为融合与否的标准，准确性和可重复性高，远远超过通过延时摄影显微镜观察细胞形态的方法，也避免了观察者对细胞形态的误判造成结果的偏差。附图说明下面结合附图及具体实施方式对本专利技术做更进一步详细说明：图1为本专利技术中的原理示意图图2为本专利技术中实施例1的细胞荧光图图3-图6为本专利技术中实施例2的细胞荧光图图7为本专利技术中延时摄影技术的观察图图8为本专利技术中病毒包装实验示意图其中标识为：1.绿色荧光阳性标记具体实施方式本专利技术中Cre重组酶能特异性识别loxpDNA序列，使loxP位点间的基因序列被删除或重组，从而实现条件性基因打靶。利用Cre/loxp系统原理，将含CTSK-Cre转基因的小鼠原代骨髓单核细胞（bonemarrowmonocytes,BMMs）和含RosamTmG的转基因小鼠原代骨髓单核细胞混合培养，并进行破骨分化向诱导。因CTSK在骨骼系统中是破骨细胞特异性表达的标志，因此Cre重组酶只在破骨细胞中表达。而RosamTmG转基因小鼠的细胞在无Cre重组酶时细胞膜表达红色荧光蛋白，而在Cre重组酶存在的情况下则通过上述Cre/loxp系统原理剪切掉红色荧光蛋白的基因而启动绿色荧光蛋白基因的表达，因此此时的细胞膜上表达绿色荧光蛋白。因此将上述两种转基因小鼠的骨髓单核细胞混合破骨向诱导培养的这个过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于研究破骨细胞融合的荧光蛋白标记方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将含CTSK‑Cre转基因的小鼠原代骨髓单核细胞和含RosamTmG的转基因小鼠原代骨髓单核细胞以3:1‑1:3的比例混合培养；（2）进行破骨分化向诱导；（3）荧光显微镜观察。

【技术特征摘要】
1.一种用于研究破骨细胞融合的荧光蛋白标记方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将含CTSK-Cre转基因的小鼠原代骨髓单核细胞和含RosamTmG的转基因小鼠原代骨髓单核细胞以3:1-1:3的比例混合培养；（2）进行破骨分化向诱导；（3）荧光显微镜观察。2.根据权利要求1所述的一种用于研究破骨细胞融合的荧光蛋白标记方法，其特征在于：所述步骤（1）中混合培养前Cre重组酶能特异性识别loxpDNA序列，使loxP位点间的基因序列被删除，从而实现条件性基因打靶。3.根据权利要求1或2所述的一种用于研究破骨细胞融合的荧光蛋白标记方法，其特征在于：所述步骤（1）中培养条件为：含10%FBS、1%P/S的DMEM培养基，37℃恒温孵箱，5%二氧化碳,95%氧气。4.根据权利要求3所述的一种用于研究破骨细胞融合的荧光蛋白标记方法，其特征在于：所述培养条件中，混合后细胞总量达到以下要求：A、96孔板细胞总量为3000-8000，D...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶玲，余钒源，吴凡子，汪成林，杨静，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51