一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶及其制备方法和应用。本发明专利技术根据毕赤酵母密码子的偏好性，对枯草芽孢杆菌的壳聚糖酶编码基因进行了优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。进一步利用毕赤酵母表达系统对该所述优化的壳聚糖酶编码基因进行高效分泌表达，获得枯草芽孢杆菌壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术获得的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶对不同脱乙酰度的壳聚糖底物均有较高的水解活性，摇瓶发酵产生的粗酶液即具有1mL(蛋白含量0.3mg)降解5g壳聚糖的水解能力，而降解相同量的壳聚糖约需要非特异性商品酶150mg，理论上效率提高500倍；具有良好的工业应用前景。

Bacillus subtilis chitosan enzyme and preparation method and application thereof

The invention discloses a Bacillus subtilis chitosan enzyme and a preparation method and an application thereof. According to the invention of Pichia pastoris codon preference of Bacillus subtilis chitosanase gene encoding optimized nucleotide sequence after optimization is shown as SEQ ID NO.2. The further use of Pichia pastoris expression system for the optimization of the chitosanase gene encoding efficient secretory expression, obtain chitosanase from Bacillus subtilis, its amino acid sequence is shown as SEQ ID NO.1. The hydrolytic activity of Bacillus subtilis enzyme chitosan deacetylation of Chitosan on different substrate were higher, crude enzymes produced by fermentation with 1mL (protein 0.3mg) hydrolysis ability of 5g degradation of chitosan, and the degradation of the same amount of chitosan is about to nonspecific commercial enzyme 150mg in theory, the efficiency is increased by 500 times; with good prospects for industrial applications.

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶及其制备方法和应用
本专利技术属于壳聚糖酶
，具体涉及一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶及其制备方法和应用。
技术介绍
壳聚糖酶(Chitosanases，EC.3.2.1.132)广泛存在于古菌、细菌及真核生物中，在糖苷水解酶(GlycosideHydrolases，GH)家族3、5、7、8、46、75及80中均有分布，其中，家族46、75及80中仅包含壳聚糖酶。在工业上，由于缺乏经济高效的特异性壳聚糖酶，往往使用蛋白酶及纤维素酶等非特异性商品酶类水解壳聚糖以制备壳寡糖。由于具有壳聚糖酶水解活性的酶类在这些商品酶中所占比例极低，用酶量较大，壳寡糖的生产成本也相应增加。因此，迫切需要研发出一系列经济高效的壳聚糖酶以满足工业壳寡糖生产的需求。本专利技术研发人员前期在多种食品级商品酶中筛选具有壳聚糖水解酶活性的酶制剂时发现，使用枯草芽孢杆菌发酵生产的淀粉酶及中性蛋白酶均具有较好的壳聚糖水解活性(1g粗酶干粉约可彻底水解30g壳聚糖)，提示这些商品酶的来源菌株枯草芽孢杆菌中具有壳聚糖酶编码基因。我们通过基因组检索发现，枯草芽孢杆菌中存在壳聚糖酶的编码基因。为获得更安全高效的壳聚糖酶，我们对该基因进行了密码子优化并在毕赤酵母中进行分泌表达。表达的壳聚糖酶能够替代现有的商品酶用于壳寡糖的规模生产。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶及其制备方法和应用；旨在提供一种经济高效的特异性壳聚糖酶。本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案如下：本专利技术通过对枯草芽孢杆菌壳聚糖酶编码基因的密码子进行优化，以利于其在毕赤酵母中实现分泌表达，从而高效快速的获得水解活性高的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶。本专利技术提供的一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术所述的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的制备方法为：将核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的壳聚糖酶基因构建至表达载体中，然后导入毕赤酵母细胞，诱导并获得分泌表达的壳聚糖酶。所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的具体制备步骤包括：(1)根据毕赤酵母密码子使用的偏好性，对来源于枯草芽孢肝菌的壳聚糖酶基因原始序列进行密码子优化；(2)将优化后的基因进行全合成并构建至表达载体pGBG1中；(3)对构建的表达载体进行酶切线性化后，舍弃含有抗性基因的片段，回收含有壳聚糖酶基因的片段并导入毕赤酵母细胞GS115中，诱导并获得分泌表达的壳聚糖酶；(4)利用诱导表达的壳聚糖粗酶上清对壳聚糖底物进行水解并使用高效液相色谱方法对产物的聚合度进行分析。本专利技术所述的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶可单独用于壳聚糖的降解制备壳寡糖；或者所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶与其他壳聚糖酶或几丁质酶混合使用，协同降解壳聚糖或几丁质。所述表达载体pGBG1的获得方式是：通过对表达载体pPIC9中的信号肽序列(详见SEQIDNO.4所示)进行密码子优化，获得适合在毕赤酵母中表达的新的信号肽序列(详见SEQIDNO.5所示)，并利用NsiI/XhoI双酶切将SEQIDNO.5所示的信号肽序列替代原先的SEQIDNO.4所示信号肽，得到表达载体pGBG1。该表达载体pGBG1能够使目的蛋白在毕赤酵母中更高效的分泌表达。其中，表达载体pPIC9和毕赤酵母细胞GS115均为商业化产品。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1.本专利技术的壳聚糖酶基因来源于枯草芽孢杆菌，使用巴斯德毕赤酵母表达系统分泌表达。枯草芽孢杆菌已被用于包括淀粉酶、蛋白酶及木聚糖酶等多种食品用酶制剂的发酵制备，菌株及其来源的酶类安全性有保障，而巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统也已被用于乳糖酶及磷脂酶C等食品级酶制剂的表达，其自身也用于木聚糖酶的生产(GB2760-2014)。因此，使用枯草芽孢杆菌来源的壳聚糖酶基因在毕赤酵母中分泌表达，其产物壳聚糖酶可成为食品级壳寡糖的生产用酶制剂。2.本专利技术中的壳聚糖酶基因由于根据毕赤酵母的密码子偏爱性进行了优化，可实现在毕赤酵母中高效分泌表达。酶活测定结果显示，发酵上清中的粗酶酶活为281800U/g，比现有专利文献(CN102816751A)中通过蜡样芽胞杆菌固体发酵并纯化获得的壳聚糖酶活性提高约10倍，且本专利技术中的粗酶液无需经过纯化即可直接用于食品级壳寡糖的制备。同时，我们将本专利技术的粗酶液与商品中性蛋白酶(来源于枯草芽孢杆菌)进行了水解壳聚糖活性对比，结果发现，本专利技术0.3mg酶可完全水解5g壳聚糖，而商品酶的对应用量则为150mg。因此，与商品酶相比，分泌表达的壳聚糖酶效率提高达500倍，具有替代现有商品酶用于规模制备壳寡糖的巨大应用潜力。附图说明图1为本专利技术实施例中的重组表达载体bscsn-pGBG1及其酶切产物凝胶电泳图谱。图2为本专利技术实施例中含壳聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌的发酵液上清的SDS-PAGE图谱。图3为本专利技术实施例中壳寡糖COS-94-BSCSN的高效液相色谱图。图4为本专利技术实施例中壳寡糖COS-62-BSCSNMALDI-TOF质谱图。图5为本专利技术实施例中壳寡糖COS-94-BSNP的高效液相色谱图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。实施例1壳聚糖酶基因的密码子优化及全基因合成在不改变氨基酸序列的前提下，对来源于枯草芽孢杆菌的壳聚糖酶编码基因进行密码子优化，优化后的密码子全部为毕赤酵母偏爱密码子，具体序列见SEQIDNO.2。优化后的核苷酸序列bscsn与原始序列(GenBankaccessionnumber:AL009126，如SEQIDNO.3所示)相比，有195个核苷酸发生了变化，核酸序列同源性为74％。同时，为了使壳聚糖酶在毕赤酵母中能够高效稳定的分泌表达，优化后的壳聚糖酶基因少了编码5’端信号肽序列的35个氨基酸，具体序列见SEQIDNO.1。优化后的基因序列委托生工进行全合成，合成获得的基因序列命名为壳聚糖酶基因bscsn。实施例2壳聚糖酶基因bscsn的表达载体构建首先使用限制性内切酶XhoI及NotI对含有壳聚糖酶基因bscsn的克隆载体进行双酶切，获得目的基因片段，同时使用相同的内切酶对表达载体pGBG1进行双酶切，回收大片段。两个回收产物进行连接，获得重组载体，命名为bscsn-pGBG1。为确定目标壳聚糖酶基因已经构建至载体中，我们分别使用XhoI/NotI及BglII对该重组载体进行双酶切及单酶切，并对产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示：经双酶切后，出现了稍大于750bp的片段，与bscsn的片段762bp相符；经BglII酶切后，出现了预期的两个片段，依次为含有目的基因的大片段和含有抗性基因的小片段。实施例3壳聚糖酶毕赤酵母工程菌的筛选及壳聚糖酶制备将获得的重组质粒bscsn-pGBG1经限制性内切酶BglII线性化后，凝胶电泳分离并切取含有目的基因的核苷酸片段(如图2所示的较大的片段)，电击导入毕赤酵母GS115中，将通过组氨酸营养缺陷MD平板上筛选得到的重组子平铺在含有胶体壳聚糖(0.5％)的BMMY琼脂平板上进行培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的编码基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的制备方法，该方法为：将核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的壳聚糖酶基因构建至表达载体中，然后导入毕赤酵母细胞，诱导并获得分泌表达的壳聚糖酶。4.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的制备方法，其特征在于：所述表达载体为pGBG1，表达载体pGBG1通过如下方式获得：将表达载体pPIC9中的信号肽序列如SEQIDNO.4所示进行密码子优化，获得适合在毕赤酵母中表达的信号肽序列如SEQIDNO.5所示；利用NsiI/XhoI双酶切，将表达载体pPIC9中如SEQIDNO.4所示的序列替换为如SEQIDNO.5所示的信号肽序列，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜昱光，程功，任立世，焦思明，孙明，冯翠，
申请(专利权)人：中科荣信苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32