温度可控的电化学汞离子传感器及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种温度可控的基于核酸外切酶Ⅲ(Exo III)目标循环信号放大的电化学Hg

【技术实现步骤摘要】
温度可控的电化学汞离子传感器及其制备方法
本专利技术属于生物分析
，具体涉及一种温度可控的电化学汞离子传感器及其制备方法，应用于核酸检测领域。
技术介绍
重金属离子Hg2+等由于它们的性质相对比较稳定，在自然环境中很难被生物降解，且具有很强的生物毒性，会通过食物链的富集最终残留在人体内，并破坏人体的各种生理功能，最终对人体的组织器官甚至于生命构成严重威胁。因此，对汞离子建立快速、可靠的检测方法的研究，在环境监测与食品安全检测等方面具有非常重要的意义。传统的重金属离子检测方法主要是依赖于大型的专业仪器，这些方法主要缺点是成本高且使用维护要求高等。因此相比之下，电化学分析技术是通过导线来感测待测物质信号的，具有仪器设备简单、操作方便易自动化、便于携带等优点，且其兼备灵敏度和准确度较高、选择性好等优点，因此常用于金属离子检测。2004年Ono小组首次提出“T-Hg2+-T”结构，即Hg2+能够与T-T错配碱基对特异性结合，形成“T-Hg2+-T”稳定的结构。将T-T作为Hg2+特异性识别基团，从而可以构建出多种的Hg2+传感分析方法。由于很低浓度的Hg2+就会对人体的健康造成严重损害，因此高灵敏度和高准确性一直是分析检测方法的改进目标。针对这一需求，一种简单、快速的基于外切酶III的信号放大方法被广泛运用于各种分子离子的高灵敏检测。外切酶Ⅲ是一种对温度变化十分敏感的生物大分子，温度低于最适温度时酶的活性较差，但过高的温度极易使酶分子结构发生不可逆转的变性导致酶失活。以往报道的电流型生物传感器，大多控制实验体系的整体温度变化，所需装置复杂，操作不易；在热电极表面构建生物传感器，可以只改变电极表面温度使酶处于最适条件而不对溶液进行整体加热，又增强了溶液对流，提高了传质速率，可缩短传感器到达稳态电流的时间，并增大电极响应信号。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种温度可控的电化学汞离子传感器及其制备方法。本专利技术利用双链DNA序列中的特殊碱基对T-T错配能够与Hg2+特异性结合，再利用外切酶III的切割作用释放Hg2+，实现对Hg2+的高灵敏分析检测；本专利技术的传感器结构简单、检测时间短、灵敏度高、选择性好，为环境监测与食品安全等方面提供了一种快速、低成本检测Hg2+的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一组用于温度可控的电化学汞离子传感器的信号探针，信号探针P1与辅助探针P2互补存在可以识别Hg2+的T-T错配结构，其核苷酸序列如下：信号探针P1：5’-SH-(CH2)6-CCCCAT(Fc)CGCCACCAGCTTCT-3’，辅助探针P2：5’-TGTAGCTGGTGGCGATCCCAC-3’；其中，信号探针P1的近5’标记了二茂铁（Fc）且其5’端有巯基化修饰。一种温度可控的电化学汞离子传感器，该传感器是基于外切酶III目标循环信号放大的电化学Hg2+传感器，其组成成分包括金盘热电极、信号探针P1、辅助探针P2和核酸外切酶III。其制备方法包括以下步骤：（1）设计并合成信号探针P1和辅助探针P2；（2）将金盘热电极打磨抛光成镜面，经二次蒸馏水超声清洗，干燥，得处理后的金盘热电极；（3）将含有信号探针P1的缓冲溶液滴加在步骤（2）中处理好的金盘热电极上，再用巯基己醇对电极表面残余位点进行封闭，得到信号探针P1修饰的金盘热电极；（4）将步骤（3）中得到的电极浸泡在含有辅助探针P2、外切酶III和不同浓度Hg2+混合缓冲液溶液中进行杂交酶切循环，反应结束后得到电化学Hg2+传感器。其中，所述步骤（2）中，打磨采用在麂皮上用氧化铝粉末打磨；超声清洗的时间为20～60s，干燥方式为氮气吹干。步骤（3）中，所述缓冲液为含有10～20mMTris-HCl，90～110mMNaCl,9～11mM三（2-羧乙基）膦的混合液，其pH为7.2～7.6。步骤（3）中，P1的浓度为1～2μM；修饰温度为20～25℃；修饰时间为1.5～2.5h；巯基己醇浓度为0.1～4mM。步骤（4）中，所述缓冲液为含有10～20mMTris-HCl，400～600mMNaCl，9～11mMMgCl2的混合液，其pH为7.2～7.6。步骤（4）中，P2的浓度为1～2μM，外切酶III浓度为1～5μ/μL，杂交酶切循环反应温度为0～40℃，反应时间为0.25～2h。步骤（4）中，通过外加直流电流调控金盘热电极温度，来控制杂交酶切循环反应过程温度。本专利技术的另一目的在于提供一种上述温度可控的电化学传感器在检测Hg2+中的应用，检测步骤如下：（1）将步骤（3）中得到的信号探针修饰的金盘热电极在10mMtris-HCl检测液与银氯化银参与电极和铂丝对比电极构成三电极系统，运用方波伏安法（SWV）进行检测，得到二茂铁的氧化电流I0(Fc)；（2）将权利要求1所述步骤（4）中最终得到的电化学生物传感器用SWV在10mMtris-HCl检测液中检测，得到二茂铁的氧化电流（IFc），然后与步骤（1）得到的I0(Fc)做差取绝对值得：|ΔIFc|=|IFc-I0(Fc)|；以|ΔIFc|对Hg2+浓度对数做线性回归方程，得工作曲线。本专利技术相对于现有技术具有如下有益效果：（1）本专利技术在设计单链信号探针过程中，将二茂铁标记在靠近巯基化5’的位置，拉近二茂铁与电极表面的距离，大大提高了电极表面二茂铁的电化学信号，同时代替了复杂的发卡结构信标分子；（2）本专利技术利用Hg2+能够与T-T错配碱基对特异性结合，形成“T-Hg2+-T”稳定的结构，提高了电化学Hg2+传感器的选择性及其在实际样品中的实用性。（3）本专利技术将外切酶III目标循环信号放大技术应用到Hg2+的检测中来，在实现高灵敏地对Hg2+进行检测（检测限达到6.1pM）的同时还具有操作简便，低成本，检测快速等优点。（4）本专利技术在金盘热电极表面构建生物传感器，可以只改变电极表面温度使外切酶III处于最适条件而不对溶液进行整体加热，增强了溶液对流，提高了传质速率，增强了外切酶III活性，促进了酶切反应的进行，并增大电极响应信号，提高检测灵敏度。附图说明图1本专利技术一种温度可控的电化学Hg2+传感器的制备过程示意图。图2实验优化条件图，杂交酶切循环过程反应时间。图3实验优化条件图，杂交酶切循环过程电极温度。图4本专利技术电化学Hg2+传感器对不同浓度的Hg2+的电化学响应。图5本专利技术电化学Hg2+传感器对其他不同金属离子的电化学响应。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本专利技术的优选实施例，以便更好地理解本专利技术，因而不应视为限定本专利技术的范围。实施例1一种温度可控的基于外切酶III目标循环信号放大的电化学Hg2+传感器的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：（1）设计一条靠近5’标记了二茂铁（Fc）的信号探针P1，所述信号探针P1与DNA辅助探针P2的互补存在可以识别Hg2+的T-T错配结构，在Hg2+存在下，P2与P1进行杂交，形成带有T-Hg2+-T结构的具有3’平端的双链结构。诱导核酸外切酶III对P1进行消解，Hg2+被释放循环利用；P1链的5’端巯基化；其中，信号探针P1的核苷酸序列为：5’-SH-(CH2)6-CCCCAT(Fc)CGCCACCA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于温度可控的电化学汞离子传感器的信号探针，其特征在于，信号探针P1与辅助探针P2存在识别Hg

【技术特征摘要】
1.一组用于温度可控的电化学汞离子传感器的信号探针，其特征在于，信号探针P1与辅助探针P2存在识别Hg2+的T-T错配结构，在Hg2+的存在下互补配对，其核苷酸序列如下：信号探针P1：5′-SH-(CH2)6-CCCCAT(Fc)CGCCACCAGCTTCT-3′，辅助探针P2：5′-TGTAGCTGGTGGCGATCCCAC-3′；其中，信号探针P1的近5’端标记了二茂铁（Fc）且其5’端有巯基化修饰。2.一种温度可控的电化学汞离子传感器，其特征在于，该传感器是基于外切酶III目标循环信号放大的温度可控的电化学Hg2+传感器，其组成成分包括金盘热电极、信号探针P1、辅助探针P2和核酸外切酶III。3.一种制备权利要求2所述温度可控的电化学汞离子传感器的方法，其特征在于，包括以下步骤：设计并合成信号探针P1和辅助探针P2；将金盘热电极打磨抛光成镜面，经二次蒸馏水超声清洗，干燥，得处理后的金盘热电极；将含有信号探针P1的缓冲溶液滴加在步骤（2）中处理好的金盘热电极上，再用巯基己醇对电极表面残余位点进行封闭，得到信号探针P1修饰的金盘热电极；将步骤（3）中得到的电极浸泡在含有辅助探针P2、外切酶III和不同浓度Hg2+混合缓冲液溶液中进行杂交酶切循环，反应结束后得到电化学Hg2+传感器。4.根据权利要求3所述的一种温度可控的电化学汞离子传感器的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，打磨采用在麂皮上用氧化铝粉末打磨；超声清洗的时间为20～60s，干燥方式为氮气吹干。5.根据权利要求3所述的一种温度可控的电化学汞离子传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述缓冲液为含有10～20mMTris-HCl，90～110mMNaCl,9...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴韶华，王芳芳，孙建军，张标，米真真，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35