一种用于检测的试剂盒制造技术

一种用于检测的试剂盒，包括设有外周壁的盒体和放置在该盒体中的容纳试剂容器的容纳装置，所述容纳装置通过枢转装置与所述外周壁枢转连接，所述容纳装置的底部设有配重使得所述试剂盒倾斜时该容纳装置仍保持水平位置，所述容纳装置包括设置有多个孔口的隔板，所述枢转装置设置在该隔板的两端，所述枢转装置的枢轴平行于携带所述盒体时盒体发生枢转的枢轴。有效避免了现有技术中在携带所述盒体行走颠簸时常常无法保持所述容器的竖直状态而产生倾斜的缺陷。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测的试剂盒
本技术涉及分子生物学
，具体涉及一种用于检测的试剂盒，特别涉及一种检测乙型肝炎患者血液中HBVPgRNA的试剂盒。
技术介绍
乙肝病毒颗粒在人体内的生命过程已经研究得很透彻：HBV的复制过程中存在逆转录的步骤，因此其生活周期不同于其它DNA病毒，由于逆转录酶的特性，HBV的突变率要高很多。HBVDNA在完整病毒中以松弛环状DNA(relaxedcircularDNA，rcDNA)的形式存，HBV病毒颗粒进入肝细胞后，脱去外面的衣壳，其rcDNA进入细胞核，形成共价闭合环状DNA(covalentltclosedCircularDNA，cccDNA)，以cccDNA为模板，转录形成前基因组RNA(PgRNA)和其它mRNA，PgRNA在逆转录酶的作用下形成rcDNA，rcDNA与相关蛋白组装形成HBV病毒颗粒。一些临床试验的研究结果表明，之所以部分HBVDNA已经检测不到，结果呈现阴性的乙肝患者的病情仍在继续，其根本原因在于患者体内病毒颗粒的核心部件没有清除干净，也没有停止工作。其中，HBVcccDNA就是目前临床上较为公认的“核心部件”之一。但是，现有的拉米夫定(LAM)等NA抗病毒药物并不能完全清除HBVcccDNA，经过较长一段时间抗病毒治疗后的乙肝患者稳定感染的细胞中，细胞核内cccDNA仍旧维持在一定的水平，每个肝细胞内约有5-50个拷贝。但是，HBVcccDNA主要存在于肝脏细胞中，取材及检测都非常困难。嗜肝DNA病毒科中的乙型肝炎病毒(HBV)是经典的DNA逆转录病毒，其进入细胞后以DNA作为模板转录出四种转录体(RNA)，转录体中有一种称为前基因组RNA，也即是PgRNA。这种RNA上带有包装信号，能够被包装入核心颗粒。研究表明，仅有PgRNA能够被包装入核心颗粒，其它类型的转录体都不能被包装进入核心颗粒，这也就意味着HBV的DNA基因组仅能由包装入核心颗粒的PgRNA逆转录得到，即DNA-RNA-DNA。鉴于PgRNA的在乙肝病毒颗粒复制过程中的重要性，它很可能成为新的NA停药指标。国内外，现在都没有获批的或科研型的成品商业化试剂盒，故开发HBVPgRNA成品试剂盒具有一定的市场独家性和应用创新性。另外，在科学研究领域，国内对PgRNA的研究寥寥无几，国外对PgRNA的研究也多集中在与HBVDNA、HBsAg等直接相关性上，没有“PgRNA与抗病毒治疗停药后复发”的关系研究。现阶段，乙肝治疗的目标是最大限度的长期抑制HBV病毒颗粒的复制，减轻肝细胞炎性坏死及肝纤维化，达到延缓和减少肝功能衰竭、肝硬化失代偿、肝癌及其他并发症的发生，从而改善生活质量和延长生存时间。在乙肝治疗用药时，现在评估“何时停药”，也即是评估“治疗终点”的指标，除了常规生化指标HBeAg、HBsAg和ALT之外，写入临床指南的分子生物学指标就是HBVDNA，大致情况如下：1)HBVDNA：依据此指标判断“何时停药”，存在延长治疗的“过度治疗”和停药后复发反弹的“再治疗”问题。另外，临床指南也明确指出此停药指标存在的问题，并提出十大待解决问题之一：寻找预测NA停药的临床标准及生物学标志。2)HBVcccDNA：检测HBVcccDNA的技术已不是问题，常见的有RT-PCR(实时聚合酶链式反应技术)和FISH(荧光原位杂交技术)。但是，国内外还没有CFDA/FDA批准的试剂盒应用，国内只存在少数科研型商品化试剂盒。HBVcccDNA检测应用为何步履维艰、难以推广呢？主要原因有：①cccDNA主要存在于肝细胞中，在血液、组织液中HBV基因组以rcDNA形式存在。若要检测cccDNA，就必须以肝组织为标本。有创活检在绝大多数医院不是常规项目，而且肝组织标本检测cccDNA难度很大；②大量的实验结果表明都没能在外周血单个核细胞中检出cccDNA；③重症肝炎前期及重症期间的患者血清中都未能检出cccDNA；④总之，cccDNA在肝组织中存在的特殊性，导致cccDNA检测技术和应用难度都很大。3)尽管HBVPgRNA也主要存在于肝细胞中，但是，类似于临床ALT(丙谷转氨酶)、AST(谷草转氨酶)在肝细胞遭到破坏后会释放入血液一样，预测HBVPgRNA也会存在于血液中，并与疾病的严重程度相关。专利预实验结果也已充分证实了乙肝患者血液中存在HBVPgRNA的结论，只是血液中HBVPgRNA含量较低，其本身也较容易被RNase降解。所以，开发稳定、可靠、灵敏的HBVPgRNA定量检测方法是解决问题的技术关键所在，专利已完成相关技术难点的攻关。4)临床上常用的拉米夫定(LAM)等抗病毒药物抑制的是PgRNA逆转录，而cccDNA的含量又相对稳定，再加上“乙肝病毒DNA基因组仅能由包装入核心颗粒的PgRNA逆转录得到”的特殊地位，血液中的HBVPgRNA含量可能是一个更好的评价患者病情的指标。5)临床上服用抗病毒药物的患者停药后1年内，约一半的患者表现出持续的病毒学应答，但是还有约50％的患者停药后很快就会复发反弹，专利预测这与患者体内“尽管HBVDNA低载量，但是HBVPgRNA高载量”的原因有关，HBVPgRNA可能成为预测NA停药的新指标。因此，采用高灵敏度、操作简单、检测时间短的RT-qPCR技术对抗病毒治疗的乙肝患者血液样本实施HBVPgRNA含量的定量测定，给“乙肝临床指南十大待解决问题之一”的“寻找预测NA停药的临床标准及生物学标志”的问题解决提供了新的思路与可能。HBVPgRNA：国内外，既没有获批的、科研型的HBVPgRNA成品商业化试剂盒，也没有PgRNA与“NA停药后复发”相关性上的研究。核苷(酸)类似物(NA)抗病毒治疗是抑制PgRNA的逆转录，最终结果是逐渐耗竭肝细胞内的cccDNA，而肝内cccDNA的含量又相对稳定(5-50个拷贝)，再加上近年来的实验研究和专利预实验已证实乙肝患者血液中PgRNA的存在性并可以检测到。故此“血HBVPgRNA定量检测试剂盒”具有市场独家性和应用创新性，有良好的经济前景和应用前景。于是，现在就推出了一种检测乙型肝炎患者血液中HBVPgRNA的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其包括如下实现步骤：样本处理：取外周血3-5ml注入无菌收集管，室温放置；HBVpgRNA的提取:使用病毒RNA提取试剂盒，提取乙型肝炎患者血清或血浆中的HBVRNA，获得HBVRNA粗品；HBVpgRNA的纯化：使用使用RNase-freeDnaseI纯化提取的HBVpgRNA，包括如下步骤：1)建立如下反应体系：RNase-FreeDNase10X反应缓冲液1ul；RNase-FreeDNase1ul/ug；RNA无核酸酶的水补足至10ul；将获得的HBVpgRNA粗品溶于洗脱液中，取1-8ul加入如下反应体系中；2)37℃孵育半小时；3)加入1ul终止液终止反应；4)65℃孵育10分钟，使DNase失活，得到HBVpgRNA的纯品；pgRNA的定量检测：使用qRT-PCR定量检测pgRNA，包括：如下步骤：1)配制qRT-PCR反应体系，qRT-PCR反应体系：PCR反应液12.5μL；引物探针混合液1.5ul；灭菌蒸馏水6μL；所述引物的上游引物包含如SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测的试剂盒，包括设有外周壁的盒体和放置在该盒体中的容纳试剂容器的容纳装置，其特征在于，所述容纳装置通过枢转装置与所述外周壁枢转连接，所述容纳装置的底部设有配重使得所述试剂盒倾斜时该容纳装置仍保持水平位置。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测的试剂盒，包括设有外周壁的盒体和放置在该盒体中的容纳试剂容器的容纳装置，其特征在于，所述容纳装置通过枢转装置与所述外周壁枢转连接，所述容纳装置的底部设有配重使得所述试剂盒倾斜时该容纳装置仍保持水平位置。2.根据权利要求1所述的用于检测的试剂盒，其特征在于，所述容纳装置包括设置有多个孔口的隔板，所述枢转装置设置在该隔板的两端，所述枢转装置的枢轴平行于携带所述盒体时盒体发生枢转的枢轴。3.根据权利要求2所述的用于检测的试剂盒，其特征在于，所述孔口与所述容器外壁设有的卡接头相卡接。4.根据权利要求2所述的用于检测的试剂盒，其特征在于，所述盒体容纳有处理试剂的处理装置，所述处理试剂的处理装置包括离心管、离心机以...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶锋，刘明坤，申大伟，
申请(专利权)人：北京旌准医疗科技有限公司，
类型：新型
国别省市：北京,11