具有提高的能源效率的非天然微生物制造技术

本发明专利技术提供了含有用于通过乙酰辅酶A或通过草酰乙酸和乙酰辅酶A提高碳通量的酶途径和/或代谢修饰的非天然微生物。本发明专利技术的实施例包括微生物，该微生物具有包含磷酸转酮酶的、获得乙酰辅酶A和草酰乙酸的途径(PK途径)。该微生物还具有(i)增强非磷酸转移酶(非PTS)系统的糖摄取活性的基因修饰，和/或(ii)在微生物的电子传递链(ETC)中的提高ATP生产效率的提高了还原当量可利用性的基因修饰，或两者兼有。所述微生物可以可选地包括(iii)维持、减弱或消除磷酸转移酶系统(PTS)的糖摄取活性的基因修饰。通过乙酰辅酶A和草酰乙酸而提高的碳通量，可用于生产生物衍生化合物，并且微生物可以进一步包括能够生产生物衍生化合物的途径。

Non natural microorganisms with improved energy efficiency

The present invention provides for containing acetyl coenzyme A or by oxaloacetate and acetyl coenzyme A enhance the enzymatic pathway of carbon flux and / or modification of non natural microbial metabolism. Embodiments of the invention include microorganisms, the microbial pathway contains phosphoketolase, acetyl coenzyme A and oxaloacetate (PK approach). The microorganism also has (I) enhanced phosphotransferase (PTS) gene modified glucose uptake activity system, and / or (II) in the electron transfer chain of microbial ATP (ETC) to improve the production efficiency of the improved reduction equivalent available gene modified, or both have. The microorganism may optionally include (III) gene modifications that maintain, attenuate, or eliminate the sugar uptake activity of the phosphotransferase system (PTS). Carbon flux increased by A acetyl CoA and oxaloacetate, can be used to produce bio derived compounds, and microorganisms may further include a way to producing bio derived compounds.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有提高的能源效率的非天然微生物优先权要求本申请要求2014年9月18日提交的名称为“具有提高的能量效率的非天然微生物(NON-NATURALMICROBIALORGANISMSWITHIMPROVEDENERGETICEFFICIENCY)”的美国临时专利申请序列号62/052,341的优先权，其公开内容通过引用并入本申请。
技术实现思路
本专利技术提供了含有增强到乙酰辅酶A、或草酰乙酸和乙酰辅酶A的碳通量的酶途径的非天然微生物，以及用于生产生物产物的方法，以及使用所述微生物制备的生物产物。一般地，提供了一种微生物，其制造乙酰辅酶A或制造草酰乙酸和乙酰辅酶A、具有磷酸转酮酶途径(PK途径)并具有(i)提高用于非磷酸转移酶系统(非PTS)的糖摄取活性的基因修饰和/或(ii)在微生物的电子传递链(ETC)中的提高ATP生产效率、提高还原当量可利用性或两者兼有的基因修饰。所述修饰提高了修饰微生物的能量效率。可选地，微生物可以包括(iii)维持、减弱或消除磷酸转移酶系统(PTS)的糖摄取活性的基因修饰。通过与本专利技术相关的实验研究，已经发现PK途径与(i)和/或(ii)以及可选地与(iii)的组合，通过乙酰辅酶A或通过草酰乙酸和乙酰辅酶A提高碳通量。这由此增加了可用于提高所需产物或其中间体(生物衍生化合物)生产的乙酰辅酶A和草酰乙酸，同时有利地最小化不期望的化合物。因此，含有通过乙酰辅酶A或通过草酰乙酸和乙酰辅酶A两者提高碳通量的酶途径，且具有如本申请所述的修饰的的非天然微生物，可以增加中间体或产物如醇的生产(例如丙二醇或丁二醇)、二醇、有机酸、烯烃、二烯(例如丁二烯)、类异戊二烯(例如异戊二烯)、有机胺、有机醛、维生素、营养剂和药物。因此，在一个方面(例如，第一方面)中，本专利技术提供了一种非天然微生物，其包括(a)乙酰辅酶A途径，或包含磷酸转酮酶途径的草酰乙酸和乙酰辅酶A的途径，和(b)增加糖摄取的非PTS活性的基因修饰。可选地，该微生物可以包括(c)维持、减弱或消除PTS糖摄取活性的基因修饰。该基因修饰包括改变PTS或非PTS的酶或蛋白质、其活性、该酶或蛋白质的编码基因或基因表达的修饰。该微生物还可以具有生物衍生化合物途径，以及通过提高乙酰辅酶A合成或草酰乙酸和乙酰辅酶A(其作为中间体)合成来提高非PTS活性以提高生物衍生化合物生产的修饰。对非PTS的修饰可以将来自磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的通量平衡为草酰乙酸和丙酮酸，这对依赖于内源性PTS系统进行糖摄取的微生物而言是一项进步，并且其可有利地进入生物衍生化合物途径。PTS和非PTS可以允许主要摄取C5、C6或C12糖及其低聚物。具有糖(例如C6、C12、糖醇和氨基糖)摄取的PTS的非天然微生物，能够通过将PEP转化成丙酮酸而使糖磷酸化。非PTS允许通过易化子或透性酶摄取糖并随后通过激酶磷酸化。非PTS还允许摄取C5糖如木糖，二糖如乳糖、蜜二糖和麦芽糖。其他底物如抗坏血酸可被特定的PTS或非PTS酶或蛋白质识别。磷酸化糖然后通过糖酵解中的大部分反应，生产与微生物的电子传递链(ETC)相关的还原当量和ATP。示例性的PK途径可以包括以下酶：果糖-6-磷酸磷酸转酮酶(1T)和磷酸转乙酰酶(1V)；所有三种果糖-6-磷酸磷酸转酮酶(1T)、乙酸激酶(1W)和乙酰CoA转移酶，乙酰辅酶A合成酶，或乙酰辅酶A连接酶(1X)；木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶(1U)和磷酸转乙酰酶(1V)；要么所有三种木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶(1U)、乙酸激酶(1W)和乙酰CoA转移酶，乙酰辅酶A合成酶，或乙酰辅酶A连接酶(1X)。第一方面中的非天然微生物，具有(a)包含磷酸转酮酶的草酰乙酸途径、乙酰辅酶A途径或草酰乙酸途径和乙酰辅酶A的途径，和(b)提高非PTS活性的基因修饰，可以可选地进一步包括一种或多种对微生物的电子传递链进行的提高ATP生产效率、提高还原当量可利用性或两者兼有的修饰。在另一方面(例如，第二方面)，本专利技术提供了一种非天然微生物，其包括(a)包含磷酸转酮酶途径的草酰乙酸途径、乙酰辅酶A途径或草酰乙酸途径和乙酰辅酶A的途径，和(b)一种或多种对微生物的电子传递链进行的提高ATP生产效率、提高还原当量可利用性或两者兼有的修饰。例如，如本申请所述的令到达细胞色素氧化酶或电子传递链的复合物IV的每电子对的易位质子数量提高的修饰，其增加了供ATP合成酶用于生产ATP的质子。因此，通过增加通过电子传输链引导的每对电子生产的ATP量，细胞的能量效率(也称为P/O比)提高。类似地，减弱或消除不传输或低效转运质子的NADH脱氢酶的修饰，增加了可用于更有效的NADH脱氢酶(如nuo)的NADH库。同样地，细胞的能量效率提高。第二方面的微生物可以包括替代碳源(例如甲醇、合成气、甘油、甲酸、甲烷)的同化途径，例如，如果PTS和非PTS被修饰、不存在于微生物中，或以其他方式不能提供期望的碳氢能源的流入。因此，制造草酰乙酸和/或乙酰辅酶A并含有磷酸转酮酶途径的微生物，还可以包括使用非糖碳底物如甘油、合成气、甲酸、甲烷和甲醇的途径。增强微生物ETC功能的修饰，包括减弱或消除与有效的电子传递链功能竞争的酶或蛋白质的表达或活性。其示例是：减弱或消除不会转移质子的NADH脱氢酶，或减弱或消除每对电子的质子易位效率较低的细胞色素氧化酶。ETC修饰还包括增强微生物的ETC的酶或蛋白质的功能，特别是当这种功能具有速率限制性时。在细菌中增强酶或蛋白质的修饰的例子是：增加ETC的复合物I的酶或蛋白质的活性，并减弱或消除全局负调控因子arcA。具有PK途径的微生物还可以在合成乙酰辅酶A和草酰乙酸之后合成琥珀酰辅酶A，而琥珀酰辅酶A可以进一步用于生物衍生化合物的产物途径。草酰乙酸是从磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸经添补反应而生产的。通过氧化TCA循环生产琥珀酰辅酶A，其中以乙酰辅酶A和草酰乙酸作为前体，经由使用草酰乙酸作为前体的还原型TCA循环，或通过氧化还原型TCA分支的组合。具有PK途径的微生物可以可选地进一步包括增加一种或多种可以使更高通量成为草酰乙酸的酶的活性，当草酰乙酸与乙酰辅酶A组合时，其可导致通过氧化型TCA和由其衍生的产物带来更高通量，或通过还原性TCA分支增加通量以用于生产琥珀酰辅酶A。可以在细胞中增加活性的酶的示例包括PEP合成酶、丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其可以存在于第一或第二方面的微生物中。可选地，具有PK途径的生物可进一步包括减弱或消除一种或多种内源性酶，以便进一步通过乙酰辅酶A或通过乙酰辅酶A和草酰乙酸增强碳通量，或对一种或多种编码所述酶的内源核酸的基因破坏。例如，所述减弱或消除的内源性酶可以是丙酮酸激酶的同功酶之一，可以令其在第一或第二方面或两者的微生物中删除。本申请所述的微生物中通过乙酰辅酶A或通过草酰乙酸和乙酰辅酶A而提高的碳通量，可用于生产生物衍生化合物。因此，在另外的方面，微生物可进一步包括能生产所需生物衍生化合物的途径。也就是说，第一或第二方面的微生物可进一步包括促进生物衍生化合物生产的一种或多种途径酶。生物衍生化合物包括醇、二醇、有机酸、烯烃、二烯、类异戊二烯、烯烃、有机胺、有机醛、维生素、营养剂和药物。在一些实施例中，生物衍生化合物是1,3-丁二醇、巴豆醇、丁二烯、3-丁烯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够生产乙酰辅酶A或生产乙酰辅酶A和草酰乙酸的非天然微生物，所述微生物包含：(a)包含用于生产乙酰辅酶A的磷酸转酮酶的途径(PK途径)；(b)用于糖摄取的非磷酸转移酶系统(非PTS)，所述系统包括增加非PTS活性的修饰；和可选地(c)减弱或消除PTS活性的修饰。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.18 US 62/052,3411.一种能够生产乙酰辅酶A或生产乙酰辅酶A和草酰乙酸的非天然微生物，所述微生物包含：(a)包含用于生产乙酰辅酶A的磷酸转酮酶的途径(PK途径)；(b)用于糖摄取的非磷酸转移酶系统(非PTS)，所述系统包括增加非PTS活性的修饰；和可选地(c)减弱或消除PTS活性的修饰。2.根据权利要求1所述的非天然微生物，其特征在于，其还包含所述微生物的电子传递链中的一种或多种修饰，所述修饰用于提高ATP生产效率，用于增强还原当量可利用性，或两者兼有。3.一种能够生产乙酰辅酶A或生产乙酰辅酶A和草酰乙酸的非天然微生物，所述微生物包含：(a)包含用于生产乙酰辅酶A的磷酸转酮酶的途径(PK途径)；和(b)所述微生物的电子传递链中的一种或多种修饰，所述修饰用于提高ATP生产效率，用于增强还原当量可利用性，或两者兼有。4.根据权利要求3所述的非天然微生物，其特征在于，还包含(c)用于糖摄取的非磷酸转移酶系统(非PTS)，所述系统包括增加非PTS活性的修饰；(d)减弱或消除PTS活性的修饰；或(c)和(d)两者兼有。5.根据前述权利要求中任一项所述的非天然微生物，其特征在于，所述PK途径包含编码PK途径酶的一种、两种或三种外源核酸，其中所述PK途径酶的表达量足以增加乙酰辅酶A的生产。6.根据前述权利要求中任一项所述的非天然微生物，其特征在于，所述PK途径包括：(c1)1T和1V；或(c2)1T、1W和1X；其中1T是果糖-6-磷酸磷酸转酮酶，其中1V是磷酸转乙酰酶，其中1W是乙酸激酶，其中1X是乙酰CoA转移酶、乙酰辅酶A合成酶或乙酰辅酶A连接酶。7.根据前述权利要求中任一项所述的非天然微生物，其特征在于，所述PK途径包括：(c3)1U和1V；(c4)1U，1W和1X；其中1U是木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶，其中1V是磷酸转乙酰酶，其中1W是乙酸激酶，其中1X是乙酰CoA转移酶、乙酰辅酶A合成酶或乙酰辅酶A连接酶。8.根据权利要求1或4所述的非天然微生物，其特征在于，所述减弱或消除PTS活性的修饰是对PTS酶或蛋白质的减弱或消除。9.根据权利要求8所述的非天然微生物，其特征在于，所述修饰降低PTS酶或蛋白质的表达从而减弱或消除PTS活性，或所述修饰降低PTS酶或蛋白质的活性以减弱或消除PTS活性。10.根据前述权利要求中任一项所述的非天然微生物，其特征在于，其具有减弱或消除的PTS酶或蛋白质的表达，其中所述PTS酶或蛋白质选自酶I(EI)、组氨酸磷酸载体蛋白(HPr)、酶II(EII)和跨膜酶IIC(EIIC)。11.根据上述权利要求中任一项所述的非天然微生物，其特征在于，其具有通过改变E1而引起的减弱或消除的PTS活性表达。12.根据上述权利要求中任一项所述的非天然微生物，其特征在于，其具有由在大肠杆菌中的ptsI或大肠杆菌ptsI同系物而引起的减弱或消除的PTS活性。13.根据权利要求1、2或4-12中任一项所述的非天然微生物，其特征在于，所述增加非PTS活性的修饰包括增加非PTS透性酶、非PTS糖激酶、易化蛋白或其组合的表达。14.根据权利要求13所述的非天然微生物，其特征在于，所述非PTS透性酶是葡萄糖透性酶，和/或所述非PTS糖激酶是葡萄糖激酶。15.根据权利要求13所述的非天然微生物，其特征在于，所述易化蛋白结合葡萄糖并由glf编码。16.根据权利要求13或14所述的非天然微生物，其特征在于，所述葡萄糖激酶由大肠杆菌glk或大肠杆菌glk同系物编码，并且所述透性酶由大肠杆菌中的galP或大肠杆菌galP同系物编码。17.根据权利要求13-16中任一项所述的非天然微生物，其特征在于，所述非PTS包含一种、两种、三种或更多种编码非-PTS酶或蛋白质的外源核酸，所述非-PTS酶或蛋白质表达量足以增加非PTS活性。18.根据上述权利要求中任一项所述的非天然微生物，其特征在于，其能够具有的糖摄取速率比不包括所述增加非PTS活性的修饰的微生物的糖摄取速率至少高10％、25％、50％、75％、100％、125％或150％。19.根据前述权利要求中任一项所述的非天然微生物，其特征在于，还包含减弱或消除丙酮酸激酶活性的修饰。20.根据前述权利要求中任一项所述的非天然微生物，其特征在于，还包含增强草酰乙酸合成的一种或多种修饰。21.根据权利要求20所述的非天然微生物，其特征在于，所述增强草酰乙酸合成的一种或多种修饰包括：增加磷酸烯醇丙酮酸(PEP)合成酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苹果酸酶或其组合的表达或活性。22.根据权利要求21所述的非天然微生物，其特征在于，所述PEP合成酶由大肠杆菌中的ppsA或大肠杆菌ppsA同系物编码。23.根据权利要求21所述的非天然微生物，其特征在于，所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶由大肠杆菌中的ppc或大肠杆菌ppc同系物编码。24.根据权利要求21所述的非天然微生物，其特征在于，所述丙酮酸羧化酶由菜豆根瘤菌Rhizobiumetli、乳酸乳球菌Lactococcuslactis中的pyc或菜豆根瘤菌Rhizobiumetli或乳酸乳球菌Lactococcuslactispyc同系物编码。25.根据权利要求21所述的非天然微生物，其特征在于，所述苹果酸酶由大肠杆菌中的sfcA或maeB、或者大肠杆菌sfcA或maeB同系物编码。26.根据权利要求1-25中任一项所述的非天然微生物，其特征在于，其进一步包含引起一种或多种选自核糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸表异构酶、转醛醇酶和转酮醇酶的酶的表达或增加表达的修饰。27.根据权利要求2-26中任一项所述的非天然微生物，其特征在于，所述非天然微生物在所述微生物的电子传递链中具有增强ATP生产效率的一种或多种修饰，所述修饰包括(i)减弱或消除不发生质子易位的NADH依赖性脱氢酶，或者(ii)减弱或消除第一细胞色素氧化酶，所述第一细胞色素氧化酶的每对电子的质子易位效率低于由所述微生物表达的具有较高质子易位效率的第二细胞色素氧化酶，或两者兼有，其中所述第一细胞色素氧化酶和第二细胞色素氧化酶是天然的或异源的。28.根据权利要求27所述的非天然微生物，其特征在于，所述第一细胞色素氧化酶和第二细胞色素氧化酶是天然细胞色素氧化酶，或所述第一细胞色素氧化酶是天然的而所述第二细胞色素氧化酶是异源的。29.根据权利要求27或28所述的非天然微生物，其特征在于，所述第一细胞色素氧化酶由cydAB、appBC、ygiN或其任意组合编码。30.根据权利要求27-29中任一项所述的非天然微生物，其特征在于，所述NADH依赖性脱氢酶是Ndh、WrbA、YhdH、YieF、YtfG、Qor和MdaB中的一种或多种。31.根据权利要求27-30中任一项所述的非天然微生物，其特征在于，所述在微生物的电子传递链中的提高ATP生产效率的一种或多种修饰，包括(i)增加天然或异源NADH脱氢酶的表达；(ii)通过减弱arcA而增加天然或异源细胞色素氧化酶的表达，或(i)和(ii)两者兼有。32.根据权利要求27-31中任一项所述的非天然微生物，其特征在于，所述非天然微生物具有增强还原当量可利用性的一种或多种修饰，其中所述还原当量为NADH、NADPH或两者皆有。33.根据权利要求32所述的非天然微生物，其特征在于，所述用于增强还原当量可利用性的修饰包括减弱或消除非(质子)易位NADH脱氢酶。34.根据权利要求33所述的非天然微生物，其特征在于，所述非(质子)易位NADH脱氢酶选自大肠杆菌Ndh、WrbA，YhdH、YieF、YtfG、Qor、MdaB及其同系物。35.根据权利要求27所述的非天然微生物，其特征在于，在所述微生物中，所述用于增强还原当量可利用性的修饰包括(i)增加丙酮酸脱氢酶的表达或活性，(ii)增加丙酮酸甲酸裂解酶和生产NADH、NADPH或二...

【专利技术属性】
技术研发人员：普里蒂·法克雅，安东尼·P·博加德，埃里克·罗兰·努涅斯万那米，
申请(专利权)人：基因组股份公司，
类型：发明
国别省市：美国,US