用于控制鞘翅目害虫染色质重塑基因亲代RNAI抑制制造技术

本发明专利技术公开涉及通过在鞘翅目害虫中对靶编码序列和转录的非编码序列的RNA干扰介导的抑制而控制鞘翅目害虫的核酸分子及其使用方法。本发明专利技术公开还涉及使表达的核酸分子对于控制鞘翅目害虫有用的方法、以及由此获得的植物细胞和植物。

Used to control insect pests, chromatin remodeling, gene parental RNAI suppression

The present invention discloses nucleic acid molecules that control coleoptera pests by inhibiting RNA interference mediated by targeting of target coding sequences and transcribed non coding sequences in Coleoptera pests, and methods of using the same. The invention also relates to methods for enabling the expressed nucleic acid molecules to be useful for controlling coleoptera pests, as well as plant cells and plants obtained therefrom.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于控制鞘翅目害虫染色质重塑基因亲代RNAI抑制优先权声明本申请要求2014年12月16日提交的美国临时专利申请系列号62/092,768、以及2015年6月2日提交的美国临时专利申请系列号62/170,076的申请日的利益，在此通过提述将二者公开全体并入本文。
本专利技术一般性地涉及由鞘翅目害虫引起的植物损害的遗传控制。在特定的实施方案中，本专利技术涉及目标编码多核苷酸和非编码多核苷酸的鉴定、及其重组DNA技术在鞘翅目害虫细胞中转录后阻遏或抑制目标编码多核苷酸和非编码多核苷酸表达从而提供植保作用的用途。背景西方玉米根虫(WCR)(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte，玉米根萤叶甲)是北美的一种破坏性最大的玉米根虫物种，在美国中西部玉米种植区受到特别关注。北方玉米根虫(NCR)(巴氏根萤叶甲)是与WCR共栖大致相同范围的近缘物种。有几种根萤叶甲属的其他相关亚种是美洲的严重害虫：墨西哥玉米根虫(MCR)[墨西哥玉米根萤叶甲(D.virgiferazeaeKrysanandSmith)]；南方玉米根虫(SCR)(十一星根萤叶甲)；黄瓜条根萤叶甲(D.balteataLeConte)；D.undecimpunctatatenella；南美叶甲(D.speciosaGermar)、和D.u.undecimpunctataMannerheim。美国农业部已估计玉米根虫每年造成10亿美元收入损失，包括8亿美元产量损失和2亿美元处理成本。WCR和NCR两者都以卵的形式在夏季期间潜伏在土壤中。这些昆虫在整个冬季都停留在卵阶段。卵是椭圆的、白色、且长度小于0.004英寸(0.1mm)。幼虫在5月下旬或6月上旬孵出，卵孵化的精确时间由于温度差异和位置而在各年间有所变化。新孵出的幼虫是白色的蠕虫，长度小于0.125英寸(3.18mm)。一旦孵出，幼虫便开始以玉米根为食。玉米根虫经历三个幼虫龄。在进食几周后，幼虫蜕皮，进入若虫阶段。它们在土壤中化蛹，然后它们在7月和8月中以成虫从土壤出现。成体根虫长度约0.25英寸(6.35mm)。玉米根虫幼虫在玉米和几种其他禾本科物种上完成发育。在黄色狗尾草上饲养的幼虫较晚出现，并且作为成虫比玉米上饲养的幼虫具有更小的头壳尺寸。Ellsbury等人，(2005)Environ.Entomol.34:627-34。WCR成虫以玉米穗丝、花粉、和暴露的穗尖上的籽粒为食。当优选的穗丝和花粉变得可得到时，成虫会快速向其移动。NCR成虫也以玉米植物的生殖组织为食。WCR雌虫通常交配一次。Bransonetal.(1977)Ann.Entom.Soc.America70(4):506-8。玉米中的大部分根虫损伤由幼虫进食引起。新孵出的根虫最初以细的玉米根毛为食，并钻入根尖中。随着幼虫长得更大，它们以初生根为食并钻入其中。在有大量玉米根虫时，幼虫啮食往往导致根部被一直修剪到玉米杆基部。严重的根损伤干扰根将水和养分转运到植物中的能力，降低植物生长，并导致籽粒产生减少，由此经常急剧降低总产量。严重的根损伤还经常导致玉米植物的倒伏，其使收获变得更难，并进一步降低产量。此外，成虫以玉米生殖组织为食可以导致穗尖的穗丝修剪。如果这种“穗丝剪切”在花粉脱落期间足够严重，则传粉可能受到破坏。可以通过作物轮作、化学杀虫剂、生物杀虫剂(例如，孢子形成革兰氏阳性细菌苏云金芽孢杆菌(Bt))、表达Bt毒素的转基因植物、或这些手段的组合来尝试控制玉米根虫。作物轮作的缺陷是限制了农田的用途。此外，一些根虫物种可以在玉米之外的作物田间产卵，或者长期的滞育(diapause)可导致卵孵化经历多年，因此会降低用玉米和其他作物实施的作物轮作的效率。化学杀虫剂是最为人们所倚重的实现玉米根虫控制的手段。然而，使用化学杀虫剂并不是完美的玉米根虫控制策略；如果把化学杀虫剂的成本与使用杀虫剂后仍可能发生的根虫害所致的产量损失的成本相加，则美国每年由于玉米根虫可能损失超过10亿美元。大的幼虫群体、大雨、和不适当的杀虫剂应用均可导致玉米根虫控制不充分。此外，杀虫剂的连续使用可能选择杀虫剂抗性根虫品系，并且由于它们对非靶物种有毒性，有严重的影响环境之虞。RNA干扰(RNAi)是一种利用内源细胞途径的方法，由此对足够大小的整个或任何部分靶基因特异性的干扰RNA(iRNA)分子(例如，双链RNA(dsRNA)分子)导致由其编码的mRNA的降解。在最近几年，在许多物种和实验系统，例如线虫秀丽隐杆线虫、植物、昆虫胚胎、和组织培养物中的细胞中，已经使用RNAi进行基因“敲低”。参见，例如Fire等人，(1998)Nature391:806-11；Martinez等人，(2002)Cell110:563-74；McManus和Sharp(2002)NatureRev.Genetics3:737-47。RNAi通过包括切丁酶(DICER)蛋白质复合物的内源途径完成mRNA的降解。切丁酶将长的dsRNA分子切割成约20个核苷酸的短片段，称作小干扰RNA(siRNA)。siRNA解旋成两个单链RNA：乘客链(passengerstrand)和引导链(guidestrand)。乘客链被降解，引导链则被整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。微核糖核酸(miRNA)在结构上是非常近似的分子，从前体分子切割而来，前体分子包含连接杂交的乘客链和引导链的多核苷酸“环”，微核糖核酸可以类似地并入RISC中。当引导链与互补的mRNA分子特异性结合并诱导RISC复合物的催化成分Argonaute被切割时，发生转录后基因沉默。已知该过程遍布在一些真核生物，例如植物、线虫和一些昆虫的体内，尽管最初的siRNA和/或miRNA的浓度有限。只有与siRNA和/或miRNA互补的转录本才会被切割和降解，因此mRNA表达的敲低是序列特异性的。在植物中，存在切丁酶基因的几种功能类群。RNAi的基因沉默效应持续数天，在实验条件下可导致目标转录物的丰度下降90％以上，导致相应的蛋白质水平的降低。在昆虫中，至少有两种切丁酶基因，其中切丁酶1促进Argonaute1的miRNA指导性降解。Leeetal.(2004)Cell117(1):69-81。切丁酶2促进Argonaute2的siRNA引导的降解。美国专利7,612,194和美国专利公开文本2007/0050860、2010/0192265、和2011/0154545披露了自玉米根萤叶甲若虫分离的9112种表达序列标签(EST)序列的文库。在美国专利7,612,194和美国专利公开号2007/0050860中提出将与其中披露的玉米根萤叶甲液泡型H+-ATP酶(V-ATP酶)的几个特定部分序列之一互补的核酸分子与启动子可操作连接，以在植物细胞中表达反义RNA。美国专利公开文本No.2010/0192265提出将启动子与核酸分子可操作连接以在植物细胞中表达反义RNA，所述核酸分子与具有未知且未公开的功能的玉米根萤叶甲基因的特定部分序列互补(该部分序列据称与秀丽隐杆线虫中的C56C10.3基因产物58％相同)。美国专利公开文本No.2011/0154545提出将启动子与核酸分子可操作连接以在植物细胞中表达反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸分子，其包含至少一个染色质重塑基因多核苷酸，其中该多核苷酸与异源启动子可操作地连接。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.16 US 62/092,768;2015.06.02 US 62/170,0761.一种分离的核酸分子，其包含至少一个染色质重塑基因多核苷酸，其中该多核苷酸与异源启动子可操作地连接。2.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸选自下组：SEQIDNO:1、3、5和7；SEQIDNO:1、3、5和7中任一者的互补物；SEQIDNO:1、3、5和7中任一者的至少15个连续核苷酸的片段；SEQIDNO:1、3、5和7中任一者的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQIDNO:1、3、5和7中任一者的根萤叶甲属(Diabrotica)生物的天然编码序列；包含SEQIDNO:1、3、5和7中任一者的根萤叶甲属生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQIDNO:139和/或SEQIDNO:140的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQIDNO:139和/或SEQIDNO:140的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQIDNO:8和/或SEQIDNO:10的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQIDNO:8和/或SEQIDNO:10的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；被转录为包含SEQIDNO:139和/或SEQIDNO:140的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和被转录为包含SEQIDNO:139和/或SEQIDNO:140的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQIDNO:79或SEQIDNO:164；SEQIDNO:79或SEQIDNO:164的互补物；SEQIDNO:79或SEQIDNO:164的至少15个连续核苷酸的片段；SEQIDNO:79或SEQIDNO:164的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQIDNO:79或SEQIDNO:164的根萤叶甲属生物的天然编码序列；包含SEQIDNO:79或SEQIDNO:164的根萤叶甲属生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQIDNO:143或SEQIDNO:167的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQIDNO:143或SEQIDNO:167的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQIDNO:101的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQIDNO:101的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；被转录为包含SEQIDNO:158的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和被转录为包含SEQIDNO:158的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQIDNO:81或SEQIDNO:165；SEQIDNO:81或SEQIDNO:165的互补物；SEQIDNO:81或SEQIDNO:165的至少15个连续核苷酸的片段；SEQIDNO:81或SEQIDNO:165的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQIDNO:81或SEQIDNO:165的根萤叶甲属生物的天然编码序列；包含SEQIDNO:81或SEQIDNO:165的根萤叶甲属生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQIDNO:144或SEQIDNO:168的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQIDNO:144或SEQIDNO:168的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；被转录为包含SEQIDNO:144或SEQIDNO:168的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和被转录为包含SEQIDNO:144或SEQIDNO:168的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQIDNO:83；SEQIDNO:83的互补物；SEQIDNO:83的至少15个连续核苷酸的片段；SEQIDNO:83的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQIDNO:83的根萤叶甲属生物的天然编码序列；包含SEQIDNO:83的根萤叶甲属生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQIDNO:145的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQIDNO:145的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQIDNO:105的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQIDNO:105的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；被转录为包含SEQIDNO:162的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和被转录为包含SEQIDNO:162的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQIDNO:85或SEQIDNO:166；SEQIDNO:85或SEQIDNO:166的互补物；SEQIDNO:85或SEQIDNO:166的至少15个连续核苷酸的片段；SEQIDNO:85或SEQIDNO:166的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQIDNO:85或SEQIDNO:166的根萤叶甲属生物的天然编码序列；包含SEQIDNO:85或SEQIDNO:166的根萤叶甲属生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQIDNO:146或SEQIDNO:169的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQIDNO:146或SEQIDNO:169的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQIDNO:103的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQIDNO:103的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；被转录为包含SEQIDNO:160的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和被转录为包含SEQIDNO:160的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQIDNO:87；SEQIDNO:87的互补物；SEQIDNO:87的至少15个连续核苷酸的片段；SEQIDNO:87的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQIDNO:87的根萤叶甲属生物的天然编码序列；包含SEQIDNO:87的根萤叶甲属生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQIDNO:147的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQIDNO:147的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQIDNO:102的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQIDNO:102的根萤叶甲属生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；被转录为包含SEQIDNO:159的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和被转录为包含SEQIDNO:159的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQIDNO:89；SEQIDNO:89的互补物；SEQIDNO:89的至少15个连续核苷酸的片段；SEQIDNO:89的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQIDNO:89的根萤叶甲属生物的天然编码序列；包含SEQIDNO:89的根萤叶甲属生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQIDNO:148的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQIDNO:148的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；被转录为包含SEQIDNO:148的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和被转录为包含SEQIDNO:148的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQIDNO:91；SEQIDNO:91的互补物；SEQIDNO:91的至少15个连续核苷酸的片段；SEQIDNO:91的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQIDNO:91的根萤叶甲属生物的天然编码序列；包含SEQIDNO:91的根萤叶甲属生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQIDNO:149的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQIDNO:149的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的互补物；被转录为包含SEQIDNO:149的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；和被转录为包含SEQIDNO:149的天然RNA分子的根萤叶甲属生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。3.一种植物转化载体，其包含权利要求1的多核苷酸。4.权利要求1的多核苷酸，其中所述生物选自下组：玉米根萤叶甲(D.v.virgiferaLeConte)；巴氏根萤叶甲(D.barberiSmithandLawrence)；十一星根萤叶甲(D.u.howardi)；墨西哥玉米根萤叶甲(D.v.zeae)；黄瓜条根萤叶甲(D.balteataLeConte)；D.u.tenella；南美叶甲(D.speciosaGermar)；和D.u.undecimpunctataMannerheim。5.从权利要求1的多核苷酸转录的核糖核酸(RNA)分子。6.从权利要求1的多核苷酸的表达产生的双链核糖核酸分子。7.权利要求6的双链核糖核酸分子，其中使所述多核苷酸序列与鞘翅目害虫接触可抑制与所述多核苷酸特异性互补的内源核苷酸序列的表达。8.权利要求7的双链核糖核酸分子，其中使所述核糖核苷酸分子与鞘翅目害虫接触可杀死害虫或抑制害虫的生长、生殖和/或进食。9.权利要求6的双链RNA，其包含第一、第二和第三RNA区段，其中所述第一RNA区段包含所述多核苷酸，其中所述第三RNA区段通过所述第二多核苷酸序列连接到所述第一RNA区段，以及其中所述第三RNA区段基本上是所述第一RNA区段的反向互补物，使得所述第一和第三RNA区段当转录成核糖核酸时杂交而形成双链RNA。10.权利要求5的RNA，其选自由长度为约15个至约30个核苷酸的双链核糖核酸分子和单链核糖核酸分子构成的组。11.包含权利要求1的多核苷酸的植物转化载体，其中所述异源启动子在植物细胞中有功能。12.用权利要求1的多核苷酸转化的细胞。13.权利要求12的细胞，其中所述细胞是原核细胞。14.权利要求12的细胞，其中所述细胞是真核细胞。15.权利要求14的细胞，其中所述细胞是植物细胞。16.用权利要求1的多核苷酸转化的植物。17.权利要求16的植物的种子，其中所述种子包含所述多核苷酸。18.自权利要求16的植物产生的商业产品，其中该商业产物包含可检测量的所述多核苷酸。19.权利要求16的植物，其中所述至少一个多核苷酸在该植物中表达为双链核糖核酸分子。20.权利要求15的细胞，其中所述细胞是玉米细胞。21.权利要求16的植物，其中所述植物是玉米。22.权利要求16的植物，其中所述至少一个多核苷酸在该植物中表达为核糖核酸分子，且当鞘翅目害虫摄食该植物的一部分时，该核糖核酸分子抑制与该至少一个多核苷酸特异性互补的内源多核苷酸的表达。23.权利要求1的多核苷酸，还包含至少一个额外的多核苷酸，所述额外的多核苷酸编码抑制内源害虫基因的表达的RNA分子。24.权利要求23的多核苷酸，其中所述额外的多核苷酸编码导致亲代RNAi表型的iRNA分子。25.权利要求24的多核苷酸，其中所述额外的多核苷酸编码抑制hunchback或kruppel基因表达的iRNA分子。26.权利要求23的多核苷酸，其中所述额外的多核苷酸编码这样的iRNA分子，该iRNA分子导致与该iRNA分子接触的鞘翅目害虫的生长和/或发育减少和/或死亡(致死性RNAi)。27.一种植物转化载体，其包含权利要求23的多核苷酸，其中每个所述的多核苷酸与在植物细胞中有功能的异源启动子可操作连接。28.一种用于控制鞘翅目害虫群体的方法，所述方法包括提供包含核糖核酸(RNA)分子的作用剂，所述RNA分子与鞘翅目害虫接触时起作用以抑制该鞘翅目害虫内的生物学功能，其中该RNA与选自下组的多核苷酸可特异性地杂交：SEQIDNO:135-163和SEQIDNO:167-169中任意者；SEQIDNO:135-163和SEQIDNO:16...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·E·纳尔瓦，K·阿罗拉，S·E·沃登，B·齐格弗里德，C·卡朱里亚，E·菲什里维奇，N·P·斯托勒，M·弗雷，R·哈姆，A·M·威莱斯阿朗戈，
申请(专利权)人：美国陶氏益农公司，内布拉斯加大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US